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Problemas con Laemmli-SDS-PAGE

Problemas con Laemmli-SDS-PAGE


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Hice Laemmli-SDS-PAGE para mi precipitado de sulfato de amonio, pero tenía una banda muy débil y una parte muy extraña al final del gel. Ayúdame a resolver ese problema. Gracias


Tu gel se ve muy bien para mí. Simplemente indica que su precipitado de sulfato de amonio contiene cantidades masivas de esta pequeña proteína en la parte inferior (sea lo que sea). Las bandas superiores se ven bien, la cantidad cargada es adecuada: no están sobrecargadas como la inferior, pero tampoco demasiado tenues. El hecho de que su primer y último carril se vean un poco manchados se debe a la gran cantidad de proteína pequeña (los carriles se ven manchados cuando se sobrecargan tanto). La banda inferior es definitivamente algo de proteína y no un artefacto de tinción; He visto esta forma antes con proteínas purificadas sobrecargadas en SDS-PAGE.

Una cosa que podría hacer, suponiendo que todavía tenga suficientes de estas muestras, es ejecutar un gel complementario con 100 veces menos material. Diluya por un factor de 1/100 en tampón de desnaturalización 1X Laemmli y cargue un nuevo gel con el mismo volumen que este. Ya no verá las bandas superiores, pero tendrá una banda inferior mucho más limpia a la que con suerte podrá asignar un peso molecular aparente (o incluso recortar para la identificación de especificación de masa; use guantes y use herramientas limpias si haga eso, de lo contrario, detectarán principalmente la queratina de su piel).

Suponiendo que el objetivo de este gel era verificar el resultado de la precipitación con sulfato de amonio utilizado como paso de purificación, obviamente no funcionó bien para separar todas estas bandas, y es posible que deba repetir y probar diferentes concentraciones. Pero si la banda inferior es la que está tratando de purificar, entonces tuvo éxito (las bandas superiores representan menos del 10% de contaminación, yo diría que según la estimación del globo ocular). Si está interesado en una de las mejores bandas, es evidente que no funcionó.

¿Es uno de estos carriles el sobrenadante? Si es así, también tiene cantidades masivas de la proteína pequeña allí (está en todos los carriles). Un enriquecimiento tan alto parece sospechoso: ¿podría ser la lisozima purificada que agregó durante el procedimiento de purificación para ayudar a descomponer la pared celular bacteriana? (suponiendo que intentas purificar una proteína sobreexpresada en E. coli).


Establecimiento de la proteína 43 de unión al ADN de TAR químicamente oligomerizable que imita la patología de la esclerosis lateral amiotrófica en células de mamíferos

Una de las características patológicas de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es la agregación citosólica mal localizada de la proteína de unión al ADN de TAR-43 (TDP-43). No solo el TDP-43 per se es un gen causante de la ELA, sino que también la mala localización y agregación de TDP-43 parece ser un cambio patológico común en la ELA tanto esporádica como familiar. El mecanismo por el que el TDP-43 nuclear se transforma en agregados citosólicos sigue siendo difícil de alcanzar, pero estudios recientes que utilizan optogenética han propuesto que la separación aberrante de fase líquido-líquido (LLPS) de TDP-43 se vincula al proceso de agregación, lo que conduce a una distribución citosólica. Aunque LLPS juega un papel importante en la formación de agregados, todavía hay varios problemas técnicos en la técnica optogenética por resolver para avanzar en el estudio in vivo. Aquí presentamos un sistema TDP-43 químicamente oligomerizable. La oligomerización de TDP-43 se logró mediante un pequeño compuesto AP20187, y el TDP-43 oligomerizado experimentó la formación de agregados, seguido de una mala localización citosólica e inducción de toxicidad celular. El TDP-43 mal localizado se coagregó con wt-TDP-43, Fused-in-sarcoma (FUS), TIA1 y secuestosoma 1 (SQSTM1) / p62, imitando la patología de ELA. El TDP-43 químicamente oligomerizable también reveló las funciones del dominio N-terminal, motivo de reconocimiento de ARN, señal de exportación nuclear y dominio de baja complejidad en la formación agregada y la localización errónea de TDP-43. Las propiedades de tendencia agregada de TDP-43 fueron mejoradas por una mutación familiar causante de ELA. En conclusión, el sistema TDP-43 químicamente oligomerizable podría ser útil para estudiar los mecanismos que subyacen a la transición de la fase de agregación de gotitas y la mala localización citosólica de TDP-43 en ALS y estudios adicionales in vivo.


1. Introducción

La electroforesis de afinidad es una técnica de separación que se basa en el fenómeno por el cual las movilidades de moléculas cargadas en un campo eléctrico de corriente continua varían según interactúen o no con otras moléculas por las que tienen afinidades. La electroforesis de afinidad se ha convertido en una técnica importante, especialmente en los sectores biológico y médico, donde se utiliza para separar y analizar macromoléculas biológicas. La primera técnica de electroforesis de afinidad, electroforesis cruzada, fue desarrollada por Nakamura. et al. [1,2]. La electroforesis cruzada se ha utilizado en la detección de complejos enzima-sustrato [3, 4, 5, 6] y en el análisis de la cinética de las reacciones antígeno-anticuerpo [7, 8]. El principio asociado a este método se ha aplicado en las técnicas de inmunoelectroforesis de cohetes e inmunoelectroforesis cruzada [9].

Se ha desarrollado una amplia variedad de técnicas de electroforesis de afinidad que proporcionan buenos resultados cualitativos o tienen buenas capacidades de separación. Una de estas técnicas pioneras es la de la afinoforesis [10], que utiliza un afinóforo, un polímero hidrófilo cargado que se une a moléculas con una afinidad adecuada. En la afinoforesis, solo las moléculas que se unen específicamente al afinóforo pueden ser inducidas a migrar mediante la aplicación de un campo eléctrico. El desarrollo de sondas de afinidad (o ligandos de afinidad), que son moléculas que tienen afinidades por moléculas específicas, ahora ocupa un papel importante en el crecimiento de la tecnología de electroforesis de afinidad. Además, también se han desarrollado técnicas de electroforesis de afinidad basadas en el retardo de la migración de moléculas que se unen fuertemente a sondas de afinidad inmovilizadas en una matriz soportada, y estas han contribuido al análisis de importantes modificaciones postraduccionales de proteínas [11,12,13, 14]. Se han desarrollado varios tipos de aparatos para electroforesis de afinidad para su uso en técnicas tales como electroforesis capilar [15,16,17] y electroforesis de microchip [18,19,20]. La electroforesis de afinidad capilar, en particular, se ha utilizado ampliamente como técnica para varios modos en el campo de las ciencias de la vida [21]. Además, la electroforesis de afinidad también se utiliza en una nueva técnica de electroforesis en la que se utiliza una membrana de poli (fluoruro de vinilideno) (PVDF) como una nueva matriz molecular soportada [22,23,24]. Se ha intentado aplicar esta técnica en separaciones por afinidad de glicoproteínas grandes [25].

Este artículo describe los avances en técnicas analíticas que involucran electroforesis de afinidad que han aparecido durante los últimos cinco años. Además, introduce una técnica para el análisis de proteínas fosforiladas que se basa en la sonda de afinidad por fosfato, Phos-tag [11,26,27,28,29,30,31,32,33], que desarrollamos, y describe las contribuciones realizadas a la fosfoproteómica mediante técnicas basadas en Phos-tag.


1. Introducción

Desde su descubrimiento en 1996 como socio de unión a RAS, la proteína de unión a la proteína activadora de Ras-GTPasa (GAP) 1 (G3BP1) se ha relacionado con una variedad de procesos biológicos, funciones moleculares y compartimentos celulares (Parker et al., 1996). ). Inicialmente sugerido para desempeñar un papel clave en la vía de señalización de Ras a través de la unión directa a Ras, la evidencia más reciente contradice esta función potencial (Annibaldi et al., 2011 Xu et al., 2013). Incluso si se debate esta función inicial, en función de su papel en el desarrollo, el metabolismo del ARN, la degradación y la respuesta al estrés, la G3BP1 parece ser una proteína de todo tipo que es fundamental para la homeostasis celular.

A lo largo de los años, se ha demostrado que G3BP1 es esencial para la supervivencia celular, ya sea como un actor clave para contrarrestar las infecciones virales (Lloyd, 2016 White et al., 2007 White & Lloyd, 2011) o en el cáncer donde se ha demostrado que ayuda a los tumores. y células cancerosas para superar la quimioterapia y las condiciones hostiles (Dou et al., 2016 Wang, Fu, et al., 2018 Zhang et al., 2015, 2019). Sin embargo, hasta la fecha, las funciones moleculares exactas de G3BP1 en un contexto fisiológico aún no se han descubierto por completo. En vivo La evidencia indica claramente que G3BP1 es especialmente importante para el desarrollo del cerebro y las actividades neuronales basales (Martin et al., 2013, 2016). La mayor parte de lo que se sabe sobre G3BP1 se centra en su vínculo con los gránulos de ARN especializados, denominados gránulos de estrés, pero en gran parte en un contexto no neuronal.

La revisión actual describirá las características genéticas y estructurales de G3BP1, así como destacará importantes interactores. También discutiremos cómo se ha demostrado que G3BP1 está implicado en varios mecanismos moleculares clave y cómo estos pueden estar asociados con enfermedades neurodegenerativas. Exploraremos más a fondo las diferencias importantes entre G3BP1 y sus parálogos G3BP2a y G3BP2b, y cómo pueden ser importantes en el SNC.


Introducción

La pandemia actual de COVID-19, causada por el SARS-CoV-2, se ha cobrado más de 2.7 millones de vidas hasta ahora y representa un desafío excepcional para nuestra sociedad, economía y ciencia. Debido a la alta morbilidad y mortalidad en los grupos de riesgo y las posibles secuelas de múltiples órganos a largo plazo, las estrategias para lograr una inmunidad de grupo natural suficiente no son aceptables. Por lo tanto, estamos siendo testigos de esfuerzos sin precedentes para desarrollar vacunas que se administrarán a la mayoría de la humanidad. Si bien afortunadamente resulta que algunas vacunas aprobadas contra el SARS-CoV-2 pueden estimular las respuestas inmunitarias que protegen de la enfermedad COVID-19 sin efectos secundarios inmediatos evidentes y contribuyen fundamentalmente a la futura contención de la pandemia (ver, por ejemplo, [1-4]), numerosos y Se están desarrollando diversas vacunas candidatas para satisfacer la necesidad de una protección rápida de los seres humanos de todas las edades y condiciones y / o prevenir la transmisión del virus. La evaluación prudente y transparente de antígenos, adyuvantes y vehículos de administración es fundamental para prevenir peligros médicos e inspirar la confianza del público en las vacunas.

De particular preocupación para la seguridad de las vacunas son los vehículos de administración potencialmente precarios, incluidos los virus de replicación recientemente desarrollados, así como las respuestas inmunes dañinas a antígenos inadecuados, conocidos como potenciación dependiente de anticuerpos (ADE). En el caso de virus respiratorios como el SARS-CoV-2, es de especial preocupación la enfermedad respiratoria potenciada asociada a la vacuna (VAERD) [5-7], que ocurrió previamente después de la vacunación con antígenos virales conformacionalmente incorrectos del virus respiratorio sincitial (RSV). Especialmente, VAERD se asoció con altos niveles de anticuerpos no neutralizantes. Una combinación de depósito de complejos inmunes, activación del complemento y respuesta inmunitaria sesgada por Th2 condujo a una intensificación de los síntomas respiratorios [8-10].

El SRAS-CoV-2 pandémico es un betacoronavirus [11-13] estrechamente relacionado con el virus del síndrome respiratorio agudo severo (SRAS) (ahora denominado SRAS-CoV-1) que surgió en 2003 [14,15]. La investigación anterior sobre el SARS-CoV-1 fue muy instructiva y proporcionó planos valiosos para el desarrollo de las vacunas COVID-19. En particular, Buchholz y sus colegas demostraron que la proteína del pico (S) de la superficie viral es la única proteína del virus que estimula los anticuerpos neutralizantes del virus (VNA) [16], que son cruciales para la mayoría de los enfoques de vacunas. En consecuencia, S es el objetivo principal de las vacunas COVID-19 y los candidatos a vacunas actuales [17] y, mientras tanto, los VNA se establecen como el principal correlato de protección después de la infección o vacunación contra COVID-19 en humanos y modelos animales [18-22]. .

La proteína S transmembrana de clase I es el principal determinante del tropismo y la transmisión del coronavirus. La proteína precursora S es procesada por proteasas celulares en las subunidades S1 maduras N-terminal y S2 unidas a la membrana [23-25]. S1 contiene el dominio de unión al receptor (RBD) responsable de la unión del virus al receptor celular principal, la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) [26, 27]. La unión del RBD al receptor da como resultado profundos reordenamientos estructurales necesarios para la fusión de la membrana por la subunidad S2 y la liberación del genoma del ARN viral en el citoplasma. Las diferencias moleculares con el SARS-CoV-1 S incluyen una mayor afinidad de unión del RBD a la molécula de ACE2 [26-28] y la presencia de un sitio de escisión multibásico, probablemente promoviendo la maduración proteolítica y el transporte de la proteína [11,23,24 ]. Es probable que estos factores contribuyan a una mayor variedad de huéspedes y órganos y al elevado grado de contagio del SARS-CoV-2 [29-31].

Como muestran los datos acumulados, los pacientes con COVID-19 desarrollan fácilmente niveles altos de anticuerpos dirigidos contra la proteína S completa, la mayoría de los cuales, sin embargo, no neutralizan la infectividad del virus. Por el contrario, la abrumadora cantidad de anticuerpos que se unen a RBD exhibe actividad neutralizante [22,32-35]. Es de destacar que se encontró que los epítopos de anticuerpos no neutralizantes de las proteínas SARS-CoV-1 y SARS-CoV-2 S potencian la infección por virus. in vitro [36,37] y se sugirió que la IgG anti-S de pacientes con COVID-19 gravemente enfermos puede promover respuestas hiperinflamatorias [38]. Por lo tanto, es aconsejable centrarse en el inmunógeno RBD para provocar anticuerpos neutralizantes potentes y evitar anticuerpos S no neutralizantes innecesarios o potencialmente dañinos.

Los virus de ARN de cadena negativa recombinantes, incluidos rabdovirus como el VEV patógeno animal [39] o el virus de la rabia zoonótica [40], son plataformas atractivas para vacunas experimentales contra enfermedades virales emergentes y desatendidas, así como para terapias inmunes oncolíticas (para revisiones recientes, véase [41 , 42]). Los rabdovirus son virus de ARN en forma de bala, citoplasmáticos y no integrantes que codifican una sola glicoproteína (G) responsable de la unión del receptor y la infección de las células. Como se ilustró anteriormente, los vectores de VSV de longitud completa o deficientes en el gen G (VSVΔG) que expresan S funcional de SARS-CoV-1 indujeron una respuesta inmune protectora en modelos animales [43, 44]. Como la patogenicidad residual del VSV recombinante de longitud completa se atribuye en gran medida a la glicoproteína G [45], una estrategia para atenuar las vacunas del VSV es la sustitución del gen G por los de las proteínas de la envoltura heterólogas, como se ejemplifica en la vacuna contra el ébola VSV-Zebov, recientemente aprobada. (Ervebo) [46]. No es sorprendente que los VSV deficientes en G que expresan proteínas S del SARS-CoV-2 S completamente funcionales se hayan preparado y propuesto rápidamente como candidatos a la vacuna COVID-19 [47-51]. Es importante destacar que, y en contraste con el SARS-CoV-1, la auténtica proteína de pico del SARS-CoV-2 puede mediar fácilmente en la propagación y amplificación de los VSV sustitutos de S en cultivos celulares, organoides y animales [43, 44, 52]. Además, VSVΔG-SARS-CoV-2 S desarrolló rápidamente mutaciones en el gen S para adaptarse a las condiciones de cultivo celular y producir virus de alto título, así como mutaciones de escape de anticuerpos [47,53,54]. Como la atenuación de VSV depende evidentemente de las glicoproteínas utilizadas para la construcción de virus sustitutos y su tropismo [55], se requieren pruebas preclínicas exhaustivas, como se hizo en el caso de VSV-Zebov (para una revisión, ver) [46], para inspirar confianza en cualquier vacuna de virus sustituto de VSV o VSVΔG replicante.

Aquí proponemos una alternativa segura y altamente efectiva tanto para los virus competentes en la replicación como para la expresión del antígeno completo del SARS-CoV-2 S para minimizar las respuestas inmunes potencialmente perjudiciales. Utilizando un diseño guiado por la estructura, desarrollamos una construcción RBD transmembrana quimérica, denominada "minispike", para una presentación de antígeno mejorada y estructuralmente correcta. En la construcción minispike, el dominio RBD se fusiona con un anclaje de tallo transmembrana C-terminal de la proteína G del rabdovirus de la rabia (RABV), para permitir una expresión eficaz como inmunógeno unido a la membrana celular. Además, la expresión del minispike a partir de vectores replicones de VSV o RABV deficientes en propagación (deficientes en G) da como resultado la secreción de VLP no infecciosas decoradas con el antígeno minispike. En particular, se descubrió que la inmunización con una dosis única de un replicón de VSV complementado con G que codifica una única copia del gen RBD minispike (VSVΔG-minispike-eGFP) protege a los ratones transgénicos K18-hACE2 de la enfermedad. Como la construcción minispike es compatible con RABV, VSV y probablemente otros rabdovirus, que son susceptibles de cambio de envoltura, el sistema minispike de rabdovirus ofrece opciones atractivas para una diversidad de regímenes de cebado / refuerzo, incluida la inmunización oral con virus complementados con RABV G.


Notas al pie

Esta investigación fue apoyada por una Beca de los Institutos Nacionales de Salud GM58442 (M.D.D.), por una Beca de Capacitación Predoctoral de los Institutos Nacionales de Salud T32-GM08700 (A.J.D.), y por una Beca de Capacitación Predoctoral de los Institutos Nacionales de Salud T32 GM008347 (J.D.O.). Este trabajo se llevó a cabo en parte utilizando instrumentación del Centro de Espectrometría de Masas y Proteómica de la Universidad de Minnesota, el Instituto de Supercomputación de Minnesota y las instalaciones del Masonic Cancer Center. Agradecemos a la Dra. Lorraine Anderson, Todd Markowski y Bruce Witthuhn del Centro de Espectrometría de Masas de la Universidad de Minnesota por su asistencia y orientación técnica.

Datos S1. Resumen de la información de péptidos del programa Scaffold utilizado para la identificación de las siete proteínas marcadas con el compuesto 6a.

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Información de soporte

S1 Higo

Las células H4 se dejaron sin tratar o se trataron con 125 & # x003bcM o 250 & # x003bcM IDN5706 durante 16 h, y los niveles de ARNm de EDEM1 se analizaron mediante RT-PCR semicuantitativa y se compararon con los niveles de ARNm de GAPDH utilizados como control.

S2 Higo

Las células H4 se dejaron sin tratar (carril 1 y 3) o se trataron con 250 & # x003bcM IDN5706 durante 16 h (carril 2) o con tunicamicina 2.5 & # x003bcg / ml durante 12 h (carril 4), seguido de transferencia Western con un anticuerpo a EDEM1. El tratamiento con tunicamicina reveló EDEM1 inmaduro no glicosilado (iEDEM1). mEDEM1, EDEM1 maduro.

S3 Higo

Las células H4 se dejaron sin tratar o se trataron con 250 & # x003bcM IDN5706 durante 16 h, y se evaluó la viabilidad celular mediante un ensayo MTT. Las barras representan la SD media & # x000b1 de cuatro experimentos independientes. NS, no significativo.

S4 Higo

Las células normales de riñón de rata (NRK) que expresan de forma estable GFP-LC3 se dejaron sin tratar o se trataron con 250 & # x003bcM IDN5706 durante 16 h, y se analizaron mediante microscopía de fluorescencia. Las barras representan la SD media & # x000b1 de la señal fluorescente de GFP-LC3 en diez conjuntos de imágenes. ***, PAG & # x0003c 0,001.

S5 Higo

Las células H4 se dejaron sin tratar (carriles 1 & # x020135) o se trataron con 250 & # x003bcM IDN5706 (carriles 6 & # x0201310) durante 16 h, seguido de cicloheximida-persecución con 150 & # x003bcg / ml de cicloheximida y 40 & # x003bcg / ml de cloranfenicol (CHX-chase) durante 1 & # x020134 h en presencia de 250 & # x003bcM IDN5706. Los extractos de células se sometieron a análisis de transferencia Western con un anticuerpo de LC3. LC3-I, LC3 no lipidada LC3-II, LC3 lipidada. Se usó transferencia Western con anticuerpo contra & # x003b2-actina como control de carga. La posición de los marcadores de masa molecular se indica a la izquierda.

S6 Higo

Las células H4 de neuroglioma humano que expresan establemente mRFP-EGFP-LC3 se dejaron sin tratar o se trataron con EBSS durante 2 h, cloroquina 0,1 mM (CQ) durante 2 h, o 250 & # x003bcM IDN5706 durante 8 h, y se analizaron mediante microscopía de fluorescencia. Las barras representan la SD media & # x000b1 de la señal fluorescente solo mRFP-LC3 (mRFP + EGFP -) de diez conjuntos de imágenes. NS, no significativo ***, PAG & # x0003c 0,001.

S7 Higo

Las células H4 se dejaron sin tratar (carril 1) o se trataron con 250 & # x003bcM IDN5706 durante los períodos de tiempo indicados (carril 2 & # x020136). Los extractos de células se sometieron a análisis de transferencia Western usando el anticuerpo anti-cola de la región citosólica C-terminal de APP. mAPP, aplicación madura iAPP, aplicación inmadura. Se usó transferencia Western con anticuerpo contra & # x003b2-actina como control de carga. La posición de los marcadores de masa molecular se indica a la izquierda.

S8 Higo

Las células H4 que expresan de forma estable una versión amiloidogénica de APP etiquetada con GFP, y que expresan de forma estable shRNA de luciferasa (shLuc de control) o shRNA de Atg5 (shAtg5), se trataron con 250 & # x003bcM IDN5706 durante 8 h (A y C) o se dejaron sin tratar ( B). Las células se fijaron y marcaron con un anticuerpo monoclonal de ratón para Calnexin, seguido de IgG anti-ratón de burro conjugado con Alexa-594 (canal rojo A-C). Las células teñidas se analizaron mediante microscopía de fluorescencia. Las barras representan la SD media & # x000b1 de diez conjuntos de imágenes de APP-GFP que indican superposición entre APP y Calnexina (A), o señal fluorescente de GFP (B y C). ***, PAG & # x0003c 0,001 NS, no significativo.

S9 Higo

Las células H4 que expresan establemente un ARNhc de luciferasa de control (shLuc) o un ARNhc específico de EDEM1 (shEDEM1) se dejaron sin tratar (carriles 1 y 3), o se trataron con 250 & # x003bcM IDN5706 durante 8 h (carriles 2 y 4). Los extractos celulares se sometieron a análisis de transferencia Western con anticuerpos específicos para LC3 y EDEM1. LC3-I, LC3 no lipidada LC3-II, LC3 mEDEM1 lipidada, EDEM1 madura. El asterisco indica una banda detectada solo en las células H4. Se usó transferencia Western con anticuerpo contra & # x003b2-actina como control de carga. La posición de los marcadores de masa molecular se indica a la izquierda.


Introducción

Las proteínas ancladas a la cola (TA) son proteínas de membrana de tipo II que albergan un único dominio transmembrana (TMD) cerca de sus extremos C-terminales y, por lo tanto, están equipadas con un dominio luminal corto característico. Los miembros de esta clase de proteínas transmembrana se encuentran en el retículo endoplásmico (RE) y sus endomembranas relacionadas, la membrana mitocondrial externa, peroxisomas y en las plantas también en la membrana externa de los plástidos (Borgese et al., 2003). Los métodos mediante los cuales las proteínas TA se dirigen correctamente al RE y la membrana externa mitocondrial, los principales sitios de integración de la membrana, han atraído una atención significativa desde que quedó claro que la importación postraduccional de estas proteínas debe ocurrir por rutas novedosas (High y Abell, 2004 Steel et al., 2002 Yabal et al., 2003). Los mecanismos que permitirían la inserción de proteínas TA en las membranas diana siguen siendo esquivos y la cuestión de si la inserción de la membrana requiere componentes proteicos de la membrana, como la partícula de reconocimiento de señal (SRP), se discute actualmente (Abell et al., 2004 Brambillasca et al. , 2005 Steel et al., 2002).

Las señales de direccionamiento de las proteínas TA generalmente se encuentran dentro de sus extremos C-terminales e incluyen el TMD. A partir de varios estudios que abordan el direccionamiento diferencial de las proteínas TA a las mitocondrias y al RE, surgió un concepto que explica la especificidad del direccionamiento mediante características fisicoquímicas generales en lugar de características específicas de secuencia de la señal de direccionamiento. Estos incluyen la longitud y la hidrofobicidad del TMD y las cargas netas de sus residuos flanqueantes. Una señal de orientación mitocondrial, por ejemplo, exhibe un TMD bastante corto con solo una hidrofobicidad moderada y regiones flanqueantes que están cargadas positivamente (Beilharz et al., 2003 Borgese et al., 2003 Hwang et al., 2004 Rapaport, 2003). Se cree que la inserción de un ancla de cola en la membrana del RE se produce de forma predeterminada, es decir, en ausencia de una señal de direccionamiento mitocondrial (o plástido) (Borgese et al., 2003), aunque SRP podría apoyar la guía de al menos algunas proteínas TA ( Abell y col., 2004). Varias proteínas TA se dirigen inicialmente al RE y posteriormente se clasifican a su destino final dentro del sistema de endomembranas como el Golgi o la envoltura nuclear a través de motivos adicionales que se encuentran dentro de su dominio citosólico (Beilharz et al., 2003). También se informó que las proteínas TA destinadas a la membrana peroxisómica utilizan un sistema bipartito de señales de orientación, una señal de orientación al RE para llevar la proteína al RE, y una señal peroxisomal, que entrega la proteína desde el RE al peroxisoma (Elgersma et al. , 1997 Mullen et al., 1999 Mullen y Trelease, 2000 Nito et al., 2001). En este caso, sin embargo, el ancla de cola en sí, en lugar del dominio citosólico, contiene la información de dirección específica del peroxisoma.

Aunque PEX3 (Hoepfner et al., 2005) y probablemente algunas otras proteínas de la membrana peroxisomal (PMP) también se dirigen primero al RE (Geuze et al., 2003 Titorenko y Rachubinski, 1998), es probable que la mayoría de las PMP se inserten en los peroxisomas. directamente del citosol (Lazarow y Fujiki, 1985). Este último proceso es facilitado por PEX19, una proteína predominantemente citosólica que también se encuentra en la membrana peroxisomal (Götte et al., 1998 Matsuzono et al., 1999). PEX19 interactúa con prácticamente todos los PMP (Fransen et al., 2001 Sacksteder et al., 2000 Snyder et al., 2000) a través de un motivo común que está presente al menos una vez (Halbach et al., 2005 Rottensteiner et al., 2004) . Esta interacción, por un lado, evita que el PMP se agregue antes de la inserción de la membrana y, por otro lado, sirve para guiar al PMP hacia la membrana peroxisomal (Jones et al., 2004 Shibata et al., 2004). Los sitios de unión a PEX19 son suficientes para el direccionamiento peroxisómico siempre que estén presentes adicionalmente uno o más TMD para anclar el fragmento dentro de la membrana (Rottensteiner et al., 2004). Se aplica un modo distinto de interacción PEX19 para PEX3 (Fransen et al., 2005 Jones et al., 2004 Mayerhofer et al., 2002), consistente con la función propuesta de PEX3 como factor de acoplamiento para PEX19 en la membrana peroxisomal (Jones et al. al., 2004 Muntau et al., 2003). Por lo tanto, el conocimiento actual sugiere la presencia de al menos dos vías de importación distintas para los PMP: una dependiente de PEX19 y otra que involucra al ER (Heiland y Erdmann, 2005).

El mamífero PEX26 pertenece a la clase de proteínas TA peroxisomales. A pesar de la falta de similitud de secuencia, PEX26 podría representar el ortólogo funcional de Pex15p en el sentido de que ambas proteínas reclutan PEX6 a la membrana peroxisomal (Birschmann et al., 2003 Matsumoto et al., 2003a). Pacientes portadores de alelos de pérdida de función de PEX26 sufren los síntomas típicos adscritos al espectro de Zellweger. A nivel molecular, la ausencia de PEX26 provoca un defecto de importación de las proteínas de la matriz peroxisomal de tipo II (Matsumoto et al., 2003b) y en gran medida también de tipo I (Weller et al., 2005).

Aquí hemos estudiado la orientación de la proteína TA de mamífero PEX26 y analizado si esto ocurre a través de la vía dependiente de PEX19. Demostramos que el dominio luminal de PEX26 contenía un sitio de unión a PEX19 típico que era capaz de dirigirse a los peroxisomas. Basándonos en estas observaciones, reexaminamos el direccionamiento de la levadura Pex15p y encontramos una composición funcional similar de su señal de direccionamiento. Discutimos nuestros hallazgos en términos de clasificación de la proteína TA peroxisomal que se habilita a través de un sitio de unión PEX19 C-terminal adjunto y que no necesariamente requiere un tránsito provisional a través del RE.


Problema de colágeno bovino tipo I de inmunotransferencia de tipo Western - (30 / Dic / 2010)

Estamos caracterizando el tipo de colágeno I la mayor parte del tiempo. Espero que aquí haya algunos especialistas en colágeno.

OK, ahora te cuento mi problema:

Tengo una dispersión de colágeno al 1% (en ácido acético 0,5M) y hago un L mmli SDS-PAGE con geles prefabricados de SERVA.
Tomo Geles Neutrales pH 7,4 y utilizo L mmli-Buffer con 2-Mercaptoetanol. Hiervo las sondas durante 5 Minutos a 95 ° C. Después de eso, centrifugo y comienzo mi Gel. Hasta aquí funciona, pero no estoy realmente satisfecho con mis resultados, a menudo obtengo una gran banda de trímero a 300 kDa y las bandas alfa 1 y 2 a aproximadamente 120 kDa son muy débiles.


Luego sequé mi gel a nitrocelulosa y hago un tinte de control con Ponceau S. Aquí veo mis bandas esperadas y mucha mancha. Quizás otras proteínas de mi extracto crudo (el colágeno no está 100% limpio, contiene algunas proteínas desconocidas)

Hasta aquí funcionó, podría optimizarse si tengo al menos la proteína de mi interés, pero luego la inmunotransferencia empieza.

Aquí utilicé un anticuerpo policlonal de conejo anti colágeno bovino I de AbD Serotec como primer anticuerpo y un pollo anti-conejo IgG AP marcado como anticuerpo secundario. Y yo tengo fondo masivo, que no proviene del segundo ab. (Probé sin el primero)

Sé que un primario policlonal no es fácil de usar, también he ofrecido un anticuerpo de colágeno monoclonal I, pero pensé que sería mejor con uno bovino. Especialmente para una validación posterior, sería bueno si funciona con este.

He intentado varias cosas para optimizar pero nada funciona,
Utilicé para Bloqueo de leche en polvo al 5%, 1 h a temperatura ambiente y sol de Bloqueo paralelo. de Candor
Hago que mis soluciones de anticuerpos sean normales en TBS-0,1% Tween 20 y 0,1% BSA y lo intenté con el tampón cruzado bajo de Candor, pero no ayuda.

Detecto con NBT / BCIP.
Mi colágeno de control de Sigma funciona bien, pero mi extracción de colágeno es totalmente rosa. Así que supongo que el primer anticuerpo se une a la proteína desconocida y a otras proteínas de la vaca.

Olvidé decirle que todavía no he probado una página nativa. Aquí tengo un problema de borrón, pero este es otro tema. Tal vez el anticuerpo funcione mejor allí, pero AbD Serotec no tiene información al respecto.

Puedo probar PVDF o incubar a 4 ° C, pero no tengo esperanzas de que algo cambie.

¿Quizás alguien más tiene más experiencia en eso?

¿Está viendo un trasfondo general o solo en los carriles?

si se trata de antecedentes generales, es posible que deba cambiar su agente de bloqueo. con un anticuerpo secundario de pollo, usaría 2-5% de suero de pollo normal (ncs) para bloquear la membrana. También agregaría 1-2% ncs a las soluciones de anticuerpos en lugar de 0.1% bsa (habría usado 1-2% bsa).

si el fondo está solo en los carriles, entonces el anticuerpo primario también está recogiendo fragmentos e isómeros del colágeno. el anticuerpo también puede no ser tan específico como usted necesita. puede que tenga que probar con un anticuerpo diferente.

Solo tengo antecedentes en los carriles con colágeno bovino, la sonda de control con colágeno de pollo tipo II es negativa.

Supongo que el primer anticuerpo forma mi base, por lo que ofrezco un primer anticuerpo monoclonal y otro segundo anticuerpo.

La pista con suero de pollo es buena, tal vez lo intente.

Hola,
Me gustaría tener el protocolo para colágeno SDS-PAGE. El colágeno obtenido por disolución del tendón con ácido acético. No estoy seguro de si el ácido acético dificultará la cuantificación de proteínas mediante el ensayo BCA y más SDS-PAGE. ¿Necesito dializar el colágeno en cualquier otro solvente antes de ejecutar el ensayo BCA y SDS-PAGE? Gracias


Mini kit de diálisis, corte de 1 kDa

Los tubos desechables del Mini Kit de Diálisis ofrecen una solución sencilla a los problemas de manipulación de diálisis de pequeño volumen. Cada uno de los tubos de diálisis del kit tiene una tapa que incorpora un pequeño disco de membrana de diálisis.

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Cambie el país en su perfil para cambiar a la tienda de otro país.

¿Por qué aumentará el volumen de mi muestra después de la diálisis?

Cuando dializa una muestra, existe una tendencia física a que el volumen aumente, ya que el tampón fuera de la membrana entra en el tubo hasta que la presión hidrostática en el interior es igual a la presión en el exterior. Esta ganancia de volumen se acerca a cero a medida que el tubo se llena de muestra. Para muestras pequeñas, la ganancia de volumen podría ser bastante significativa, en porcentaje. ¿Es aceptable esta dilución? Si no es así, utilice uno de los kits de limpieza, que precipita las proteínas y permite resuspenderlas en el volumen que elija el usuario.

Would dialyze overnight at room temperature cause degradation of my sample?

Would dialyze overnight at room temperature cause degradation of my sample?

It's always a possibility, but considering that most users will be rehydrating their IPG strips with sample overnight at room temperature anyway, this additional step shouldn't result in any additional degradation. Furthermore, the dialysis usually occurs against a strongly denaturing mixture (e.g., 8 M urea) which would denature proteases as well.

Still, if this is a concern, dialysis can be performed at 4 °C.

Should I use the 8 kDa cut-off or the 1 kDa cut-off?

Should I use the 8 kDa cut-off or the 1 kDa cut-off?

For 2-D electrophoresis, you are generally better off using the 8 kDa cut-off. The larger the cut-off, the faster and more complete the dialysis will be. There will be some loss of polypeptides below 8 kDa, but these smaller polypeptides don't show up in standard SDS-PAGE anyway.* Therefore, there will be no effect on the 2-D spot pattern if the 8 kDa cut-off is used rather than the 1 kDa cut-off.

*NOTE: Standard Laemmli SDS-PAGE (which uses Tris-Cl buffer in the gels and Tris-glycine running buffer) cannot resolve polypeptides of MW 14 kD and lower. These small proteins migrate at the dye front. To resolve such small polypeptides, a Tris-Tricine system is commonly employed [Schagger, H. and Von Jagow, G. (1987). Analytical Biochem. 166, 368].

Can I perform desalting techniques instead of TCA/acetone precipitation to get rid of endogenous small ionic molecules?

Can I perform desalting techniques instead of TCA/acetone precipitation to get rid of endogenous small ionic molecules?

Yes, small ionic contaminants can be removed using the Mini Dialysis Kit. This product is designed for the dialysis of small sample volumes with minimal handling and sample loss, offering a simple solution to the handling problems of low-volume dialysis and reducing the pronounced streaking on 2-D gels caused by low-molecular-weight contaminants.

How long should I dialyze my sample?

How long should I dialyze my sample?

Because there is so much diversity among samples, it is difficult to give a definitive recommendation. However, overnight dialysis should be recommended to begin with.


Ver el vídeo: Laboratório em Bioquímica - Eletroforese SDS-PAGE (Junio 2022).


Comentarios:

  1. Ordwald

    Lo siento, nada de lo que no pueda ayudarte. Pero estoy seguro de que encontrará la solución correcta. No te desesperes.

  2. Moncreiffe

    ¿Esto no tiene análogos?

  3. Hadi

    Buena pregunta

  4. Nairne

    Está usted equivocado. Ingrese lo discutiremos. Escríbeme en PM, lo manejaremos.



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