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¿Qué es un protocolo simple para teñir células en suspensión?

¿Qué es un protocolo simple para teñir células en suspensión?


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Soy un estudiante de ingeniería que estudia cómo los campos eléctricos afectan a las células, específicamente los fenómenos de electroporación en células vivas.

Sé que la electroporación se usa ampliamente para introducir genes en las células, pero realizar un experimento de transfección completo no es tan factible en el laboratorio en el que estoy trabajando.

Mi pregunta es:

Si quiero demostrar el principio de la electroporación, es decir, que las células se abren e ingieren sustancias del entorno, utilizando algún tipo de tinte que luego pueda visualizar, ¿cuál podría ser un buen modelo para este tipo de experimento? Específicamente, ¿qué tinte, qué células podrían usarse para esto?


Obtendrá muchos falsos positivos utilizando el siguiente método, y una transfección real de una proteína fluorescente es siempre el camino a seguir, porque entonces probará que la transfección fue realmente exitosa.

Dicho esto, puede intentar usar DAPI, seguido de microscopía de fluorescencia o citometría de flujo. DAPI es una tinción muy brillante para el ADN y no puede atravesar una membrana celular intacta. Si la membrana celular se rompe, e. gramo. por necrosis, DAPI entrará en la célula. Nunca he visto a nadie tratando de probar la electroporación de esta manera, pero valdrá la pena intentarlo. Podría ser que el tiempo sea demasiado corto para que DAPI ingrese a la celda, por lo que deberá modificar su configuración.

Intentaría lo siguiente: Prepare una solución celular con DAPI (debería bastar con una concentración de 5 µM). Divida la solución en dos cubetas de electroporación, realice la electroporación con una cubeta, deje la segunda sin tocar como control. Después de la electroporación, analice las muestras MOMENTARIAMENTE (es decir: dentro de unos minutos) utilizando un citómetro de flujo (si es posible).

En cuanto a las celdas, podrías usar cualquier cosa. Sugiero células eucariotas porque son más fáciles de visualizar que las bacterias. Sin embargo, necesitaría una campana de flujo laminar para el manejo aséptico de las células. En teoría, también podría usar bacterias, que son más fáciles de manejar, pero no tengo experiencia con la inmunofluorescencia en bacterias.


Protocolo de tinción celular para microscopía

La microscopía se refiere a la práctica que implica el uso de un microscopio con el fin de observar estructuras a pequeña escala que no se pueden ver a simple vista y, a menudo, la tinción celular es necesaria ya que las estructuras son difíciles de discernir debido a un contraste insuficiente.

La tinción celular es una técnica que se utiliza con el objetivo principal de aumentar el contraste cambiando el color de algunas de las partes de la estructura que se observan, lo que permite una visión más clara. Existe una variedad de tinciones que se pueden usar en microscopía.

En primer lugar, la tinción puede ser in vivo o in vitro. La diferencia entre estos es que mientras que la tinción in vivo se refiere a la tinción de una materia biológica mientras aún está viva, la tinción in vitro se refiere a una técnica de tinción en la que la materia biológica no es viva.

Las siguientes son manchas comunes que explican técnicas, preparaciones y procedimientos para cada una:

Tinción con hematoxilina y eosina

Se trata de dos tinciones que se utilizan en el examen de láminas delgadas de tejido biológico. El contraste es creado por las tinciones donde la hematoxilina vuelve azul el núcleo mientras que la eosina hace que el citoplasma y otras partes se vuelvan rosa o rojo.

1- Medir 10 gramos de cristales de hematoxilina 500 ml de agua (70-80 grados centígrados) y mezclar para diluir completamente

2- En un frasco aparte, medir 20 gramos de alumbre y mezclar con 500 ml de agua caliente del grifo (70-80 grados)

3- Mezclar las dos mezclas juntas (1 y 2)

Mientras que el alumbre es el mordiente, el timol previene el crecimiento de hongos.

5- A continuación, la mezcla se mantiene en un matraz traslúcido alejado de la luz solar directa durante una semana. Esta se cubre con una toalla de papel que permite la circulación del aire (maduración temprana). Luego, la solución se coloca en un matraz oscuro y se tapa herméticamente después de una semana, y se almacena en un lugar oscuro durante 3 semanas. (Maduración tardía)

1- Mida 10 gramos de cristales de eosina y añádalos a mezclar en 1000ml de agua caliente del grifo (70-80 grados). Esto debe mezclarse para diluir y almacenarse en un matraz oscuro. Esto se puede utilizar directamente.

1- Se tiñe un corte rehidratado en una solución de hematoxilina durante 20 a 40 minutos.

2- La sección se lava luego con agua del grifo durante unos 3 minutos hasta que se vuelve azul,

3- La sección es la diferenciada en etanol al 70 por ciento que contiene 1 por ciento de HCL durante unos 5 segundos para eliminar el exceso de tinte y permitir que emerja el nuclear.

A continuación, se lava con agua del grifo,

5- Teñir con eosina durante 10 minutos,

6- Luego lavar durante aproximadamente 1 a 5 minutos con agua del grifo,

7- Deshidratar, limpiar y montar en una rejilla.

Lesión de sarcoma de Kaposi con tinción de hematoxilina-eosina - Cambridge University Press http://www.cambridge.org

Tinción de Papanicolaou

Esto también se conoce como tinción de Papanicolaou o frotis de Papanicolaou. Se utiliza para examinar muestras de células que se han obtenido de fluidos corporales.

La técnica implica la combinación de productos químicos que incluyen:

o Verde claro SF amarillento,

La solución diferenciadora ACCUMATE está lista para su uso. Se prepara un sustituto del agua del grifo de Scott mezclando una parte del concentrado de sustituto de agua del grifo de Scott con 9 partes de agua desionizada. A continuación, se filtran los reactivos del sistema de tinción de papanicolaou antes de su uso.

1- Fijar los portaobjetos en fijador acético durante 15 minutos,

2- Alcohol absoluto durante dos minutos,

3-70 por ciento de alcohol durante 2 minutos,

4- en 50 por ciento durante 2 minutos

5- Agua del grifo durante 2 minutos,

6- profundamente en hematoxilina durante 4 minutos,

7- Enjuagar brevemente con agua del grifo,

8- Diferenciar en alcohol ácido durante unos 5 segundos,

10- Deshidratar con alcohol absoluto dos veces,

11- Mancha en naranja G durante diez segundos,

12- Enjuagar en alcohol absoluto dos veces.

13- Mancha en E.A 50 durante dos minutos,

14- Mancha en alcohol absoluto dos veces,

15- Transparente en xileno tres veces,

16- Monte el portaobjetos en xileno tres veces,

a) Presencia de un cuerpo de psammoma en ausencia de células atípicas en el frotis cervicovaginal (tinción de Papanicolaou, 200 ×) B) Cistoadenofibroma de ovario seroso con cuerpos de psammoma parietal (hematoxilina y eosina, 100 ×).

Pusiol et al. CytoJournal 2008 5:7

Fucsina ácida y básica Mancha

La fucsina ácida es un tinte ácido rojo magenta que se usa principalmente para la tinción de plasma, mientras que la fucsina básica es un tinte básico magenta que se usa principalmente para teñir el núcleo.

La técnica también se conoce como tinción ácido-resistente. Las bacterias acidorresistentes tienen una sustancia cerosa (ácido micólico) en su pared celular que las hace impermeables a los procedimientos de tinción.

Se utiliza el término ácido resistente ya que resisten la decoloración con alcohol ácido. Carbol fucsina, el tinte primario contiene fenol, que ayuda a solubilizar la pared celular, mientras que se usa calor para aumentar la penetración del tinte.

Al usar alcohol para decolorar, las células se decolorarán excepto las acidorresistentes. El azul de metileno se utiliza como contratinción para cualquier celda que se decolore. Al final del procedimiento, las células acidorresistentes permanecen rojas / rosadas, mientras que las no acidorresistentes conservan un color azul.

Preparación de carbol fucsina mezclando dos soluciones:

Solución 1 - 0,2 gramos de fucsina básica y 10 ml de etanol al 95 por ciento,

Solución 2-5 gramos de fenol y 90 ml de agua destilada,

1- Limpiar las larvas de pulpa para permitir que la pulpa se extienda sobre el portaobjetos y se seque.

2- Fijar con calor flameando sobre un quemador varias veces,

3- Inunda con 0,2 por ciento de carbol fucsina durante unos 30 segundos,

4- Lavar la mancha y luego secar al aire / secar suavemente antes de examinar

Una microfotografía de Mycobacterium smegmatis (rosa) y Micrococcus luteus (azul) Ampliación de 1000x. Mycobacterium smegmatis es ácido, reteniendo el colorante carbol fucsina, apareciendo así de color rosa. Micrococcus luteus no es resistente a los ácidos, pierde el carbol fucsina durante la decoloración y se tiñe con azul de metileno.

Imagen de: http://inst.bact.wisc.edu

Mancha de Wright

Este es un tipo de tinte metacromático de Romanowsky que se prepara mezclando un tinte de azul de metileno especialmente tratado con eosina.

La porción ácida de la mancha se une con los componentes básicos de las células, como la hemoglobina, y por lo tanto se denominan eosinofílicos y se tiñen de rosa o rojo.

Los componentes ácidos de la célula, como los ácidos nucleicos, toman el tinte básico y se tiñen de azul o púrpura.

El pH debe controlarse con un tampón de 6,4 a 6,7 ​​para evitar una tinción deficiente.

o Mida 1,0 gramos de polvo de tinción de Wright y 400 ml de metanol (alcohol metílico),

o Agregue algunas perlas de vidrio para ayudar a disolver y agregue el etanol a la mancha,

o Mezcle bien a intervalos hasta que el polvo se haya disuelto por completo (hágalo calentando en un baño de agua a 37 C para ayudar en la disolución),

o L abel las botellas y márquelas como inflamables y tóxicas,

o Bien apretado encima y guárdelo a temperatura ambiente en la oscuridad.

1- Preparar un relleno de la muestra y dejar secar en un portaobjetos,

2- Preparar tres recipientes, y llenar uno con un paso de Tinte de Wright y los otros dos con agua destilada,

3- Mantenga la mancha bien tapada cuando no esté en uso para evitar la evaporación (siempre reemplace la mancha una vez que sea insuficiente)

4- Siempre reemplace el agua destilada una vez que comience a formarse espuma iridiscente en la superficie, o cuando comience a ponerse azul,

5- Sumerja el portaobjetos en la mancha durante 15 a 20 segundos,

6- Sumerja el portaobjetos en agua destilada en el segundo recipiente durante 15-45 segundos,

7- Sumerja el portaobjetos en el recipiente 3 durante 25 segundos con inmersiones rápidas,

8- Limpiar la parte posterior de la diapositiva,

9- Secar el portaobjetos en posición vertical, sobre la superficie absorbente y evitar secar el frotis,

10- Aplicar aceite para examinar microscópicamente,

Estos pasos deben repetirse dos veces para los frotis de médula.

1- Preparar la muestra y dejar secar al aire,

2- Coloque la diapositiva sobre una rejilla,

3- Aplicar el tinte de Wright en un solo paso utilizando frascos cuentagotas,

4- Espere unos 15-30 segundos y agregue volúmenes similares de agua destilada,

5- Vierta la mezcla de tinte y agua del portaobjetos,

6- Sumerja el portaobjetos en agua destilada durante unos 25 segundos con inmersiones rápidas,

7- Limpie la parte posterior de la diapositiva,

8- Secar el portaobjetos en posición vertical por el lado absorbente y evitar secar el frotis,

Estos pasos deben repetirse dos veces para las muestras de médula ósea.

Imagen de: http://www.vetmed.vt.edu

Tinción de Gram

Esta es una de las técnicas de tinción más comunes.

Se utiliza principalmente para diferenciar especies de bacterias como gram positivas o gram negativas. Esto se logra a través de las propiedades químicas de las paredes de las células bacterianas, donde se muestran diferentes colores después de la tinción.

Esta técnica se basa en el hecho de que la pared celular grampositiva tiene una fuerte atracción por el violeta cristal después de la adición de yodo en comparación con la pared celular de los gramnegativos.

El yodo es el mordiente y forma un complejo con el cristal violeta, que se elimina fácilmente de la pared celular gramnegativa con alcohol etílico.

Tinción celular en Microscopía es útil y necesario para resaltar aquellos elementos estructurales de su muestra / espécimen para ser observados adecuadamente. Hay otros que MicroscopeMaster puede cubrir en el futuro, así que marque esta página y vuelva a visitarla para ver más información sobre tinción.

Obtenga más información sobre el cultivo celular, la división celular, la diferenciación celular y los tipos y técnicas de cultivo de tejidos. Y eche un vistazo a las razones para considerar la compra de un kit de tinción de microscopio.

Mallory F.B. A.M, M.D. S.D. Técnica patológica. Filadelfia y Londres. W.B. Compañía Sunders. Copyright, 1938, de W.B. Compañía Sunders. Reimpreso en junio de 1942 y septiembre de 1944. Pgs. 70 y 9

Johnson PL, Klein MN: Aplicación de la tinción de Papanicolaou a secciones de parafina. Técnica de tinción 31: 223, 1956

Delisle, G. y L. Tomalty. 2002. Mycobacterium tuberculosis. MicrobeLibrary, Sociedad Estadounidense de Microbiología, Washington, DC.

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El material de esta página no es un consejo médico y no debe usarse para diagnóstico o tratamiento. Aunque se ha tenido cuidado al preparar esta página, no se puede garantizar su precisión. La comprensión científica cambia con el tiempo.

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Subcultivo de células en suspensión

Los siguientes protocolos describen procedimientos generales para el subcultivo de células de mamíferos en cultivo en suspensión. Tenga en cuenta que el procedimiento para pasar células de insectos difiere del de las células de mamíferos en varios pasos cruciales. Para obtener más información, consulte Notas sobre el subcultivo de células de insectos.

Para pasar su propia línea celular, le recomendamos que siga de cerca las instrucciones proporcionadas con cada producto que está utilizando en sus experimentos. Las consecuencias de desviarse de las condiciones de cultivo requeridas para un tipo de célula particular pueden variar desde la expresión de fenotipos aberrantes hasta un fracaso completo del cultivo celular.

Pasando Culturas en Suspensión
El subcultivo de células en suspensión es algo menos complicado que el paso de células adherentes. Debido a que las células ya están suspendidas en el medio de cultivo, no es necesario tratarlas enzimáticamente para separarlas de la superficie del recipiente de cultivo, y todo el proceso es más rápido y menos traumático para las células. El reemplazo del medio de crecimiento no se realiza en cultivos en suspensión, sino que las células se mantienen alimentándolas cada 2 a 3 días hasta que alcanzan la confluencia. Esto se puede hacer diluyendo directamente las células en el matraz de cultivo y continuar expandiéndolas, o retirando una porción de las células del matraz de cultivo y diluyendo las células restantes hasta una densidad de siembra apropiada para la línea celular. Por lo general, el período de retraso que sigue a los pases es más corto que el observado con los cultivos adherentes.


Desagregación de tejidos

Picar tejidos

Después de la disección de tejidos sólidos de un organismo, antes de introducir las enzimas digestivas, los tejidos deben enjuagarse para limpiar cualquier sangre u otro material no deseado. Luego, los tejidos deben picarse y dispersarse con tijeras, un bisturí o una cuchilla para aumentar la superficie total. Esto aumenta el contacto entre las enzimas y la superficie de los tejidos, lo que conduce a una digestión más eficiente y completa al tiempo que acorta el tiempo requerido para la digestión.

Enzimas

Los tejidos mantienen unidas a las células, sostenidas por la matriz extracelular y las uniones célula-célula compuestas por un conjunto diverso de proteínas y otras moléculas biológicas que requieren enzimas específicas para una digestión adecuada y la eliminación de la suspensión celular. Las enzimas digestivas que juegan un papel esencial en la desagregación de los tejidos sólidos se resumen en la Tabla 1. La primera categoría de enzimas a considerar son aquellas enzimas que descomponen la matriz extracelular. La dispasa es una proteasa neutra comúnmente utilizada aislada de bacterias, con un alto nivel de especificidad enzimática para el colágeno IV y la fibronectina 21, 22. La dispasa es útil en el desprendimiento de colonias celulares y la disociación de trozos de tejido en pequeños grupos de células, ya que trabaja para escindir las uniones entre las células y la matriz extracelular sin afectar las uniones célula-célula 23. Sin embargo, se debe tener precaución al digerir tejidos con dispasa, ya que es capaz de escindir moléculas de superficie o antígenos específicos relevantes, como los relacionados con el análisis de células T 24, 25. Por lo tanto, puede ser útil omitir la dispasa del tampón de digestión si se observa una pérdida de epítopos. También es eficaz en la disgregación de la matriz extracelular la colagenasa. La colagenasa es capaz de romper los enlaces peptídicos presentes en el colágeno, lo que ayuda a digerir la matriz extracelular, liberando las células en suspensión. Es importante señalar que las enzimas colagenasa purificadas son más efectivas que la colagenasa tradicional derivada naturalmente de bacterias ya que hay menos variabilidad en la composición de la enzima purificada, aumentando la estabilidad de las células a lo largo de la digestión tisular 26. La última enzima a considerar en la digestión de la matriz extracelular en tejidos sólidos es la hialuronidasa. El hialuronano, un proteoglicano estructural en la matriz extracelular, es degradado por la familia de enzimas hialuronidasas, que se producen tanto en organismos bacterianos como en vertebrados. Estas enzimas hialuronidasas rompen el enlace β1,4-glicosídico presente en la porción de glicosaminoglicano del hialuronano 27, contribuyendo a la digestión de la matriz extracelular.

-Rompe la matriz extracelular

- Elimina las uniones entre las células y la matriz extracelular.

-Rompe la matriz extracelular

-Rompe los enlaces peptídicos presentes en el colágeno.

-Rompe la matriz extracelular

-Elimina los enlaces glucosídicos en hialuronano

-Evita la agregación celular

-Cierra las uniones célula-célula

-No altera la expresión del antígeno como lo haría la tripsina

El siguiente grupo de enzimas a considerar en la preparación de una suspensión de una sola célula incluye las enzimas que rompen las uniones célula-célula. La tripsina es una proteasa natural sintetizada en el sistema digestivo de los organismos vertebrados. Aunque es útil para degradar ciertas proteínas presentes en las uniones célula-célula, la tripsina también tiene un efecto muy severo sobre las proteínas de la membrana celular 1. Además, se ha demostrado que la tripsina conduce a la agregación de células inducida por ADN libre, lo que indica que la lisis celular se está produciendo dentro de la suspensión 28. Por lo tanto, la tripsina se evita tradicionalmente en la preparación de una suspensión de células individuales a partir de tejidos sólidos para experimentos de citometría de flujo. La papaína es una proteasa alternativa derivada de la planta de papaya. Se sabe que la papaína degrada las proteínas que forman las uniones estrechas entre las células 29. Sin embargo, al igual que la tripsina, se ha demostrado que la papaína conduce a la agregación de células inducida por ADN libre debido a la lisis celular que se produce durante la digestión enzimática 28.

El último tipo de enzima a considerar en la preparación de una suspensión de una sola célula es la desoxirribonucleasa (DNasa), que actúa para escindir los enlaces fosfodiéster de la cadena principal del ADN. Los dos tipos principales de DNasa son DNasa-I y DNasa-II, que poseen funciones enzimáticas ligeramente diferentes. La DNasa-II no es adecuada para la preparación de una suspensión de una sola célula, ya que desempeña un papel en las vías de degradación del ADN mediadas por el engullimiento implicadas en la apoptosis 30, 31. La DNasa-I es apropiada para la digestión de tejidos y la preparación de una suspensión de una sola célula, ya que previene la agregación celular al degradar el ADN libre liberado a través de la lisis de células muertas durante la digestión enzimática sin iniciar vías apoptóticas. Cloruro de calcio (CaCl2) actúa como un activador enzimático de DNasa-I y, por lo tanto, se introduce en el cóctel de digestión durante la digestión enzimática. Los iones de calcio (Ca 2+) se unen estrechamente a la enzima DNasa-I para estabilizar su conformación activa y permitir la degradación adecuada del ADN libre 32.

Para evitar los posibles problemas causados ​​por la adición de las enzimas anteriores a un cóctel de digestión de tejidos, se han desarrollado y optimizado cócteles de digestión disponibles comercialmente. Accutase es una mezcla de proteasa y colagenasa disponible comercialmente que imita la acción de la tripsina y la colagenasa, pero lo hace en una concentración mucho más baja que la necesaria cuando se utilizan las enzimas estándar. Accutase contiene una mezcla de enzimas con actividad proteolítica, colagenolítica y DNasa y produce un mayor rendimiento celular total y una mejor conservación general del antígeno en comparación con el uso de un cóctel de enzimas similares para la digestión tisular 33, 34. TrypLE es otro cóctel de enzimas disponible comercialmente que contiene enzimas recombinantes purificadas que imitan la actividad de la tripsina sin alterar la expresión de los antígenos de la superficie celular [35]. Este producto evita los problemas que surgen con el uso de tripsina en la digestión de tejidos y permite una mejor supervivencia celular y una preparación de suspensión de células individuales más eficiente.

Disociación enzimática y mecánica

La disociación enzimática se lleva a cabo introduciendo un cóctel de digestión en tejidos sólidos picados e incubando a temperaturas específicas, según el cóctel de enzimas que se utilice. Las enzimas pueden ser específicas de la temperatura y, por lo tanto, funcionan con la máxima velocidad y eficiencia a una temperatura determinada, comúnmente 37 ° C. Dependiendo de las enzimas específicas, la disociación enzimática también se puede realizar a 4 ° C o en hielo. Estas temperaturas más bajas probablemente ralentizarán la velocidad de reacción de las enzimas y extenderán el período de incubación, pero pueden ayudar a minimizar la muerte celular. La fuerza de la enzima y la concentración de la enzima son los dos factores más importantes a considerar al elegir un cóctel de digestión para la preparación de una suspensión de células individuales para citometría de flujo. Las enzimas con alta resistencia o alta concentración pueden comprometer los marcadores de la superficie celular presentes en las células, lo que puede afectar la disponibilidad de estos marcadores y la viabilidad de las células en experimentos posteriores. Por lo tanto, las células poco adherentes, como los linfocitos, deben aislarse mediante un período de digestión corto con una enzima suave o suave para evitar estos problemas 36. La determinación de la fuerza y ​​concentración óptimas de las enzimas que se utilizan en la disociación enzimática es empírica y fundamental para el aislamiento adecuado de las células y la digestión exitosa de los tejidos.

La disociación mecánica juega un papel en la preparación de una suspensión de una sola célula a partir de tejidos sólidos a lo largo de la disociación enzimática. Para ayudar en la disociación mecánica de los tejidos, mediante la cual las células se liberan de la matriz extracelular en suspensión, la digestión enzimática se puede llevar a cabo en un agitador orbital. Después de la disociación enzimática, la suspensión debe filtrarse para excluir cualquier fragmento de tejido no digerido o agregados de la suspensión de células individuales recién preparada.


16: Mancha simple

Para teñir la muestra bacteriana para microscopía, primero se debe preparar el frotis en el portaobjetos. Básicamente, esto implica tres pasos: transferir una suspensión líquida de la bacteria en el portaobjetos, secar el frotis y luego calentar ligeramente para unir firmemente el frotis al portaobjetos. Una vez hecho esto, comienza el procedimiento de tinción.

NO espese demasiado las suspensiones de frotis. El tinte no penetrará bien y habrá demasiadas células bacterianas para ver formas y arreglos individuales. Hay que tener cuidado con los frotis gruesos al tomar la muestra de un medio de agar.

RECOMENDACIÓN: Puede resultarle útil dibujar un círculo (el lápiz de cera es mejor) en el lado opuesto del portaobjetos donde extenderá el frotis. Esto le ayudará más adelante a localizar el frotis, lo que a veces es un problema al mover el portaobjetos de un lado a otro en busca de las bacterias. El lápiz de cera es mejor que un marcador porque no se quita fácilmente del vidrio.


Procedimiento

    Obtener una suspensión uniforme de células.: Siga el protocolo de neutralización de tipsinización / tripsina para el tipo de célula específico. Coloque la suspensión celular en un tubo de centrífuga cónico de tamaño adecuado. Para obtener un recuento de células exacto, es necesaria una suspensión uniforme que contenga células individuales. Pipetee la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo en el tubo 5-7 veces usando una pipeta con un diámetro pequeño (pipeta de 5 ml o 10 ml). Para las células descongeladas de la crioconservación (en 1 ml de medio de crioconservación), pipetear hacia arriba y hacia abajo de 7 a 10 veces con una pipeta de 1 ml.

Para una determinación precisa, el número total de células por encima de 1 mm 2 debe estar entre 15 y 50. Si el número de células por 1 mm 2 excede 50, diluya la muestra y vuelva a contar. Si el número de células por 1 mm 2 es inferior a 15, utilice una muestra menos diluida. Si no hay disponibles muestras menos diluidas, cuente las células en ambos lados del hemocitómetro (áreas de 8 x 1 mm 2).

Mantenga un recuento separado de células viables y no viables. Si más del 25% de las células no son viables, el cultivo no se mantiene en la cantidad adecuada de medio. Vuelva a incubar el cultivo y ajuste el volumen del medio de acuerdo con la confluencia de las células y la apariencia del medio. Incluya celdas en la parte superior e izquierda tocando la línea media. Las celdas que tocan la línea media en la parte inferior y derecha no se cuentan.

I. El azul tripán es la "tinción vital" excluida de las células vivas.
ii. Las células vivas aparecen incoloras y brillantes (refráctiles) bajo contraste de fase.
iii. Las células muertas se tiñen de azul y no son refráctiles.

  • % Viabilidad celular = [Células viables totales (no teñidas) / Células totales (viables + muertas)] X 100.
  • Células viables / ml = Recuento medio de células viables por cuadrado x Factor de dilución x 10 4 /
  • Recuento medio de células viables por cuadrado = Número total de células viables en 4 cuadrados / 4.
  • Factor de dilución = Volumen total (Volumen de muestra + Volumen de líquido diluyente) / Volumen de muestra.
  • Células viables totales / Muestra = Células viables / ml x El volumen original de líquido del que se extrajo la muestra de células.
  • Volumen de medio necesario = (Número de células necesarias / Número total de células viables) x 1000.

Conclusiones

El protocolo de aislamiento de HTF presentado aquí es un método simple y rápido para obtener un gran número de células (1,3 × 10 6 fibroblastos positivos para vimentina) de una única biopsia de trabeculectomía de 2-3 mm × 1 mm dentro de aprox. 25 días. Nuestro protocolo puede permitir la configuración sencilla de bancos de células en condiciones de laboratorio y para nuevas pruebas de fármacos oftalmológicos in vitro. También se demostró que el 5% de FGF-EMEM es una mejor opción que el 10% de DMEM para la propagación rápida de HTF antes de la preparación de los experimentos. Sin embargo, en el caso de los estudios que tienen como objetivo evaluar el efecto de un agente probado sobre la tasa de proliferación o la capacidad de producción de colágeno tipo I, el 5% de FGF-EMEM debe usarse solo para el aislamiento de HTF, y luego el 10% de DMEM debe aplicarse para configuración experimental, ya que el 5% de FGF-EMEM afecta significativamente las divisiones celulares y la capacidad de formación de ECM de los fibroblastos.


Protocolos de preparación de muestras

La microscopía confocal se estaba convirtiendo en algo más que una novedad a principios de la década de 1980 debido al aumento en las aplicaciones de la fluorescencia de campo amplio para investigar la arquitectura y la función celular. A medida que las técnicas de inmunofluorescencia, así como la tinción de estructuras subcelulares con fluoróforos sintéticos, se volvieron ampliamente practicadas a fines de la década de 1970, los microscopistas se sintieron cada vez más frustrados por su incapacidad para distinguir o registrar detalles finos en instrumentos de campo amplio debido a la interferencia de la emisión de fluorescencia que ocurre arriba y abajo. el plano focal. Hoy en día, la microscopía confocal, cuando se combina con la aplicación de nuevos fluoróforos sintéticos avanzados, proteínas fluorescentes y reactivos de inmunofluorescencia, es uno de los métodos más sofisticados disponibles para sondear la estructura subcelular. Los protocolos descritos en esta sección abordan las técnicas de preparación de muestras que utilizan fluoróforos sintéticos acoplados a inmunofluorescencia que son necesarios para investigar células adherentes fijas y crioscopias de tejido utilizando microscopía de fluorescencia confocal y de campo amplio.

Dos días después de la inducción de tamoxifeno, las células epiteliales en el hoyo interpapilar expresan colores aleatorios, lo que indica que múltiples clones proliferaron de forma independiente. Sin embargo, después de 84 días, cada hoyo interpapilar estaba ocupado por células de un solo color, lo que indica que se derivan de células madre monoclonales. (Nature Cell Biology 15, 511–518, 2013)

Datos de imagen cortesía de:
Hiroo Ueno (Doctorado)
Departamento de Patología de Células Madre, Universidad Médica de Kansai

En la Figura 1 se presenta una imagen confocal de escaneo láser que revela la extensa red de actina filamentosa presente en el tejido del músculo liso de una criosección delgada (8 micrómetros) de diafragma de rata. La criosección de tejido se marcó con un cóctel que contenía Alexa Fluor 488 conjugado con faloidina (actina de tinción) y Texas Red-X conjugado con aglutinina de germen de trigo (dirigidas a lectinas). Además, los núcleos de la muestra se contratiñeron con Hoechst 33342. Las imágenes se registraron en escala de grises con un Olympus FluoView FV1000 acoplado a un microscopio invertido IX81 utilizando iones de argón (línea de 488 nanómetros), diodo violeta (405 nanómetros) y helio verde. láseres de neón (543 nanómetros). Durante la etapa de procesamiento, los canales de imagen individuales se pseudocolorearon con valores RGB correspondientes a cada uno de los perfiles espectrales de emisión de fluoróforos.

Protocolos de tinción

Células adherentes de tinción triple con MitoTracker, Phalloidin (o Phallacidin) y colorantes nucleares

La vitalidad y las propiedades físicas de las células adherentes cultivadas en cubreobjetos en placas de Petri se pueden determinar utilizando una combinación de tintes fluorescentes. Este protocolo detalla un procedimiento generalizado para teñir una variedad de tipos de células.

Tinción de células adherentes con anticuerpos primarios de filamento intermedio y fluoróforos sintéticos

Las líneas de fibroblastos y células epiteliales derivadas de humanos y animales de laboratorio producen muestras fluorescentes de colores brillantes que resaltan proteínas específicas en la red de filamentos intermedios cuando se tiñen.

Tinción de células y criosecciones de tejido con anticuerpos primarios de tubulina, falotoxinas y fluoróforos sintéticos

Las líneas celulares y las secciones de tejido de mamíferos derivadas de humanos y animales de laboratorio, incluidos intestino, riñón, testículos, músculo, hígado y pulmones, producen muestras fluorescentes de colores brillantes.

Tinción de células adherentes con anticuerpos primarios de citoqueratina y fluoróforos sintéticos

Las líneas de células epiteliales derivadas de humanos y animales de laboratorio producen muestras fluorescentes de colores brillantes que detallan la red de filamentos intermedios de citoqueratina cuando se tiñen con anticuerpos de queratina.

Criosecciones de tejido de tinción triple con aglutinina de germen de trigo, faloidina y colorantes nucleares

La mayoría de las secciones de tejido comunes derivadas de animales de laboratorio, incluidos intestino, riñón, testículos, músculo, hígado y pulmones, producen muestras fluorescentes de colores brillantes que detallan una amplia variedad de características anatómicas cuando se tiñen.

Inmunofluorescencia con criosecciones de tejido cerebral

Entre las dianas de anticuerpos que a menudo se etiquetan en secciones de tejido cerebral se encuentran la proteína ácida fibrilar glial (GFAP), neurofilamentos neuronales y axonales, clase III beta-tubulina, proteínas asociadas a microtúbulos, proteínas de la barrera hematoencefálica y antígenos asociados con enfermedades específicas.

Inmunofluorescencia con criosecciones flotantes de tejido cerebral

La inmunofluorescencia indirecta es una técnica que permite la visualización de objetivos específicos utilizando una combinación de anticuerpos primarios y secundarios. Este protocolo detalla un procedimiento para teñir criosecciones flotantes cerebrales congeladas de más de 30 micrómetros de espesor.

Autores colaboradores

Nathan S. Claxton, Gregory K. Ottenberg, John D. Griffin, Scott G. Olenych, y Michael W. Davidson - Laboratorio Nacional de Alto Campo Magnético, 1800 East Paul Dirac Dr., Universidad Estatal de Florida, Tallahassee, Florida, 32310.


Protocolo de citometría de flujo: tinción con marcadores de superficie celular

Nota: Este método es adecuado para la tinción de la superficie celular en citometría de flujo.

Los marcadores de superficie celular se expresan en la superficie celular y se pueden usar para definir subtipos de células, así como también funcionan cuando se marcan con anticuerpos marcados con fluorescencia y se analizan mediante citometría de flujo. Como esas proteínas de superficie son accesibles a los anticuerpos, se pueden teñir fácilmente sin pasos de permeabilización que son críticos para la tinción intracelular.

  • PBS: Disuelva 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,15 g de Na2HPO4 y 0,2 g KH2correos4 in 800 mL distilled water. Adjust the pH to 7.4 with HCl and final volume to 1 liter with additional distilled H2O.
  • Cell staining buffer: Add 0.5% BSA and 0.05% Sodium Azide (NaN3) to PBS.
  • Fc receptor binding reagents
  • Conjugated primary antibodies
  • Conjugated secondary antibodies, if needed

Sample preparation:

1. Harvest the desired tissues and cells, prepare a single cell suspension and adjust the suspension to a concentration of 1 x 10 6 cells/mL in cell straining buffer.

Blocking Fc-receptors (optional):

2. Blocking Fc receptors is useful to reduce non-specific immunofluorescent staining. Add 1 μg of Fc receptors binding reagents per 1 x 10 6 cells and incubate for 10 minutes at room temperature.

  • For mouse cells, purified anti-mouse CD16/CD32 antibody specific for Fcγ R III/II (cat. no. CABT-45660RM) can be used to block the Fc receptors.
  • For human cells, purified human Fc receptor binding inhibitor solution can be used to eliminate non-specific staining.
  • In the absence of an effective/available blocking antibody for Fc receptors, an alternative approach is to block cells with excess irrelevant purified IgG from the same species and same isotype as the antibodies used for immunofluorescent staining.

Nota: Do not wash excess blocking reagents from this reaction.

3. Add appropriately primary antibody with previously determined optimum concentration and vortex. Incubate on ice for 15 to 30 minutes.

Nota: If using primary antibodies directly conjugated with fluorochrome, the incubation should be carried out in the dark, and then skip to Step 7.

4. Wash cells with cell staining buffer to remove any unbound antibodies. Centrifuge at 300-400 x g for 5 minutes at 4°C and discard supernatant.

6. Add an appropriate fluorescent-conjugated secondary antibody with recommended concentration. Incubate on ice for 15-20 min in the dark.

7. Repeat Step 4 three times.

8. Resuspend cell in 200-500 uL cell staining buffer for final flow cytometric analysis.


Immunofluorescence protocol (IF protocol)

Immunofluorescence is one of the widely used techniques in modern biology and medicine, and it is developed by Coons et al. (1950), and it is a combination of immunofluorescence technique and morphological technology to develop immune fluorescent cells (or tissue). The development of fluorescence immunoassay technology is very fast in recent years, especially in the field of medical, biological and environmental studies, it is widely used in the determination of endocrine hormones, growth factors, proteins, nucleic acids, neurotransmitters, receptors, in vivo drug and infectious sources, and so on, these subjects have been developed. According to the detection of different samples can be divided into three major categories.
There are two different immunofluorescence assay which include indirect immunofluorescence assay and direct immunofluorescence assay.For indirect immunofluorescence assay, the protocol mainly include tissue or cell preparation, tissue or cell fixation, serum blocking, primary antibody incubation, marked second antibody incubation, staining, result judgment and imaging. For direct immunofluorescence assay, there are only marked primary antibody been incubated without second antibody and other steps are same.
For direct immunofluorescence assay, specific fluorescent antibody was prepared by the combination of specific antibodies and fluorescein. It is the most simple and fast method for the examination of cell or tissue antigen. This method is highly specific and is commonly used in renal biopsy and pathogen examination. Its disadvantage is that a fluorescent antibody can only examine one kind of antigen, which is less sensitive. For indirect immunofluorescence assay, specific antibodies against the corresponding antigen, fluorescein labeled anti - antibody (anti - specific IgG fluorescent antibody) and the primary antibody
Although the basic steps and principles of immune fluorescence are the same, but because of the specific conditions are not the same, the detailed operation steps of each laboratory will not be exactly the same. For example, the use of the solution, the fixed liquid and antibody dilution liquid will be slightly different. Here to give a more common method, the detailed use of the operation can be based on the steps to adjust and change, and ultimately determine the most appropriate method for youself.

Indirect Immunofluorescence / IF

1. Prepare tissue or culture cells
2. Prepare tissue section or cells coverlip
3. Wash samples two times with PBS
4. Fix amples with 4% paraformaldehye in PBS for 15 min at room temperature(Note: Paraformaldehye is toxic, use only in fume hood)
5. Aspirate fixative, rinse two times in PBS for 5 min each
6. Permeabilize samples with 0.1-0.5% triton x-100 in PBS for 10 min(Note: Permeabilization is only required when the antibody needs access to the inside of the cells to detect the protein. These include intracellular proteins and transmembrane proteins whose epitopes are in the cytoplasmic region.
7. Aspirate triton x-100, rinse two times in PBS for 5 min each
8. Incubate samplels in 10% normal goat serum in PBS for 30 min at room temperature
9. Aspirate goat serum, incubate sections with primary antibody at appropriate dilution in PBS overnight at 4°C or 1 hour at 37°C(optimal condition should be confirmed in different laboratory)
10. Rinse three times in PBS for 5 min each
11. Incubate samplels with fluorochrome-conjugated secondary antibody at appropriate dilution in PBS for 1 hour at 37°C in dark(optimal condition should be confirmed in different l aboratory)
12. Rinse three times in PBS for 5 min each in dark
13. Incubate samples with 1 μg/ml DAPI
14. Mount samples with a drop of mounting medium

Direct Immunofluorescence / IF

1. Prepare tissue or culture cells
2. Prepare tissue section or cells coverlip
3. Wash samples two times with PBS
4. Fix amples with 4% paraformaldehye in PBS for 15 min at room temperature(Note: Paraformaldehye is toxic, use only in fume hood)
5. Aspirate fixative, rinse two times in PBS for 5 min each
6. Permeabilize samples with 0.1-0.5% triton x-100 in PBS for 10 min(Note: Permeabilization is only required when the antibody needs access to the inside of the cells to detect the protein. These include intracellular proteins and transmembrane proteins whose epitopes are in the cytoplasmic region.
7. Aspirate triton x-100, rinse two times in PBS for 5 min each
8. Incubate samplels in 10% normal goat serum in PBS for 30 min at room temperature
9. Aspirate goat serum, incubate sections with fluorochrome- conjugated primary antibody at appropriate dilution in PBS overnight at 4°C or 1 hour at 37°C(optimal condition should be confirmed in different laboratory)
10. Rinse three times in PBS for 5 min each in dark
11. Incubate samples with 1 μg/ml DAPI
12. Mount samples with a drop of mounting medium


Ver el vídeo: Lavado de Células (Junio 2022).


Comentarios:

  1. Hananel

    Está de acuerdo, es la admirable respuesta.

  2. Shakagrel

    En mi opinión, están equivocados.

  3. Regenfrithu

    Disculpe, que te interrumpiera, yo también me gustaría expresar la opinión.

  4. Mazum

    Bravo, que palabras..., una gran idea



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