Información

2.1: Amplificar el ADN que codifica el aptámero - Biología

2.1: Amplificar el ADN que codifica el aptámero - Biología


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Introducción

Cuando era becario postdoctoral, el profesor Niles examinó una biblioteca aleatoria de aptámeros de ARN para encontrar uno que se una al hemo, el sitio que contiene hierro en la hemoglobina. Se sabe que el hemo puede unirse a ciertos factores de transcripción y modular la expresión génica (ver referencias Zhang y Hach, 1999 y Ogawa, et al., 2001), y los aptámeros de ARN son una herramienta potencial para aprender más sobre las redes de señalización que involucran al hemo. Un aptámero llamado "6-5" sobrevivió a la sexta ronda de selección, pero finalmente se descubrió que no se unía al hemo. Un aptámero llamado "8-12" sobrevivió a las 8 rondas de cribado y tiene una afinidad de unión al hemo de 220 nM. Ambos fueron descritos en el Niles, et al., 2006 papel al que se hace referencia a continuación.

Hoy se le entregarán dos plásmidos de archivo que contienen las secuencias 6-5 y 8-12, respectivamente. El ARN no es muy estable en comparación con el ADN; por tanto, los aptámeros de ARN se copian en sus secuencias de ADN asociadas para su almacenamiento a largo plazo. La ligadura del fragmento de ADN en un plásmido que se puede transportar en bacterias proporciona mayores capacidades de amplificación y almacenamiento. Usaremos estas capacidades de manera más extensa en el Módulo 2.

Para seleccionar y amplificar solo el fragmento de ADN corto que codifica el aptámero, utilizará la reacción en cadena de la polimerasa, PCR. La PCR comprende tres pasos principales: 1) se funde el ADN molde que contiene una secuencia deseada, 2) los cebadores se hibridan con ubicaciones específicas en el ADN ahora derretido (es decir, de una sola hebra), y 3) los cebadores se extienden mediante una polimerasa para seleccionar y crear el producto deseado. La extensión se produce a ~ 70 ° C, se funde a ~ 95 ° C y el recocido a una temperatura de ~ 5 ° C por debajo de la temperatura de fusión del cebador; por tanto, la repetición de estos pasos se denomina ciclo térmico. Después de cada ciclo, los productos recién formados se convierten en plantillas, provocando una amplificación exponencial de la secuencia seleccionada. (Tenga en cuenta que las primeras rondas de PCR no producirán el producto deseado; veremos por qué en la conferencia previa al laboratorio de hoy).

Una vez que se esté ejecutando la PCR, comenzará a explorar algunas herramientas computacionales para el análisis de ARN. Durante este módulo, finalmente utilizará tres programas diferentes para explorar las similitudes de secuencia entre los aptámeros candidatos de ARN y las estructuras de orden superior que surgen de las secuencias primarias. Por hoy, observará los grados de similitud de secuencia entre una lista de aptámeros, algunos de los cuales se unen al hem y otros no.

Según las numerosas aplicaciones de la PCR, puede parecer que la técnica ha existido desde siempre. De hecho solo tiene 25 años. En 1984, Kary Mullis describió esta técnica para amplificar ADN de secuencia conocida o desconocida, dándose cuenta de inmediato del significado de su intuición.

"¡Querido Thor!", Exclamé. Había resuelto los problemas más molestos de la química del ADN con un solo rayo. Abundancia y distinción. Con dos oligonucleótidos, la ADN polimerasa y los cuatro nucleosidetrifosfatos, pude hacer tanta secuencia de ADN como quisiera y podría hacerlo en un fragmento de un tamaño específico que pudiera distinguir fácilmente. De alguna manera, pensé, tenía que ser una ilusión. De lo contrario, cambiaría la química del ADN para siempre. De lo contrario, me haría famoso. Fue demasiado fácil. Alguien más lo habría hecho y seguramente yo habría oído hablar de ello. Lo estaríamos haciendo todo el tiempo. ¿Qué estaba fallando en ver? "Jennifer, despierta. He pensado en algo increíble". -Kary Mullis de su Conferencia Nobel, 8 de diciembre de 1983.

(Copyright © The Nobel Foundation 1993. Todos los derechos reservados. Este contenido está excluido de nuestra licencia Creative Commons. Para obtener más información, consulte http://ocw.mit.edu/fairuse.)

Referencias

Zhang, L. y A. Hach. "Mecanismo molecular de señalización de hemo en levadura: el activador transcripcional Hap1 actúa como mediador clave." Cell Mol Life Sci 56, no. 5-6 (30 de octubre de 1999): 415-26.

Ogawa, K. y col. "El hemo media la desrepresión del elemento de reconocimiento de Maf a través de la vinculación directa al represor de transcripción Bach1." EMBO J 20, no. 11 (1 de enero de 2001): 2835-43.

Niles, J. C. "Utilización de aptámeros de ARN para sondear una red celular regulada por hemo fisiológicamente importante." ACS Chem Biol 1, no. 8 (19 de septiembre de 2006): 515-24.

Protocolos

Parte 1: Práctica de laboratorio

Usted y su pareja pueden trabajar juntos en la práctica de laboratorio. (Nota: este no será el caso para exámenes futuros). Por supuesto, puede dar diferentes respuestas si no está de acuerdo.

Parte 2: Amplificar el aptámero de codificación de fragmentos de ADN

Antes de comenzar el trabajo de laboratorio húmedo de hoy, es posible que desee limpiar sus pipetas y su mesa de trabajo con etanol al 70%.

  1. Se le administrarán plásmidos que codifican el ADN de dos aptámeros: "6-5" y "8-12", ambos a ~ 250 μg / mL. Haga un plan para agregar 2.5 ng de ADN a cada reacción de PCR, en no más de 20 μL de volumen final de plásmido y agua.
    • Tenga en cuenta que es posible que deba diluir el ADN en serie. Por ejemplo, si necesita diluir el ADN 10,000 veces para alcanzar una concentración de 2.5 ng / 20 μL, entonces debe hacer una dilución 1: 100 del stock original, luego una dilución 1: 100 de la solución resultante. Es mejor pipetear al menos 5 μL de solución a la vez, para evitar las imprecisiones asociadas con el pipeteo de volúmenes muy pequeños. Siéntase libre de ejecutar su plan por parte de la facultad de enseñanza.
  2. Por reacción, agregue 20 μL de PCR Master Mix, 5 μL de cada cebador, la plantilla de ADN y agua de modo que el volumen total de la reacción sea de 50 μL. Además de las dos reacciones que contienen ADN, debe preparar un control sin plantilla que contenga agua pura sin plásmido.
    • ¿Qué significaría si su control sin plantilla resultara en una amplificación de ADN del mismo tamaño que sus aptámeros?
  3. La PCR se ejecutará durante aproximadamente 1 hora, en el siguiente ciclo:
SEGMENTOSCICLOSTEMPERATURA (° C)TIEMPO
11944 min
2-4259430 segundos
5730 segundos
7230 segundos
517210 minutos
614indefinido

Parte 3: Introducción al análisis computacional

Su comprensión de este módulo será evaluada en parte por el Asignación de análisis computacional de ARN. Aunque hoy no estará preparado para comprender toda la tarea, hasta que comprenda mejor lo que implica SELEX, debería poder comenzar bien en la primera sección.

  1. Empiece por leer la descripción general de la tarea y la información general. (Está bien si esto último aún no tiene perfecto sentido).
  2. Descargue el archivo de datos asociado y lea los antecedentes. Una vez más, el texto introductorio puede tener más sentido en una semana o dos.

Análisis de cebadores

Tenga en cuenta que todas las secuencias en el archivo de datos se muestran de 5 'a 3'.

  1. Comience copiando la cadena de sentido del ADN que codifica la biblioteca SELEX en un nuevo documento de Word.
    • Asegúrese de seguir con la fuente Courier para que cada base tenga el mismo tamaño.
  2. Determine y escriba la hebra complementaria antisentido (de 3 'a 5') directamente debajo de la hebra con sentido.
  3. ¿A qué hebra se templará el cebador de 5 '? Copie y pegue para alinear el cebador con dicha hebra; muéstrelo por encima o por debajo de las dos hebras de ADN molde, no entre ellas. Resalta la imprimación en negrita.
  4. ¿A qué hebra se templará el cebador de 3 '? Alinee esta imprimación con dicha hebra y resalte en negrita. Asegúrese de que los pares de bases complementarios estén alineados. ¿Qué tuvo que hacer con la cartilla para que esto sucediera?
  5. Entregue su diagrama básico (y las respuestas a las preguntas anteriores) con su cuaderno hoy.

Alineación de secuencia

  1. Hoy trabajará en la parte uno de la asignación computacional, es decir, alineación de secuencia usando el programa CLUSTAL. Es posible que aún no pueda abordar todas las preguntas interpretativas, pero puede comenzar a responder las analíticas más sencillas, como las partes de 2, 3 y 4.
  2. Para capturar la captura de pantalla de la figura requerida, puede usar el Tomar utilidad en una Mac.
    • Busque "Grab" con el reflector (el icono con forma de lupa en la esquina superior derecha) o vaya a AplicacionesUtilidades Tomar.
  3. No es necesario que registre su trabajo en esta parte en su cuaderno.

Para la proxima vez

  1. Continúe familiarizándose con el funcionamiento de OpenWetWare. Específicamente, debes:
    • Agrega tu página de usuario a la página Personas de la clase.
    • Complete el cuestionario / registro del estudiante para entregarlo la próxima vez.
  2. La principal evaluación de este módulo será la Informe de ingeniería de ARN. Empiece a familiarizarse con su estructura y contenido esperados.
  3. Dentro de una semana, en la sesión del Día 3 del Módulo 1, tendremos una discusión en clase sobre un artículo de la literatura científica primaria. Puede comenzar a leer y pensar en el periódico ahora, en lugar de intentar hacerlo solo en los dos días entre el Día 2 y el Día 3.

Lista de reactivos

  • Mezcla maestra de PCR (2.5X)
    • 62,5 U / ml Taq ADN polimerasa
    • KCl 125 mM
    • Tris-HCl 75 mM, pH 8,3
    • 3,75 mM de Mg (OAc) 2
    • 500 μM cada dNTP
  • Imprimación delantera: stock de 20 μM
  • Imprimación del inversor: 20μM stock
  • Plantillas: 8-12 y 6-5

Anormalidad en el ADN del faraón egipcio: ¿era un híbrido alienígena?

Los antiguos egipcios intentaron borrar su legado de la historia, por lo que se sabe muy poco sobre él. Pero lo que sabemos sobre este gobernante nos hace preguntarnos quién o qué era realmente. A diferencia de todos los faraones anteriores que fueron retratados en excelente forma física, la apariencia de Akhenaton es sorprendentemente extraña: ojos en forma de almendra, un abdomen pequeño, miembros delgados, un cráneo alargado.

Akhenaton y monoteísmo n. ° 8217

Un antiguo faraón egipcio Akhenaton

Akhenaton puso patas arriba a todo Egipto, creando el mayor acto de herejía que los egipcios jamás habían conocido. Afirmó que los egipcios ya no deberían haber creído en un panteón de varios dioses, sino adorar a un dios. En este sentido, se asume que Akhenaton y el personaje bíblico Abraham pueden haber sido la misma persona. Los investigadores han descubierto los cuerpos de muchos faraones y sus familiares en forma momificada, pero nunca se ha encontrado una momia de Akhenaton. & # 8220Pero las estatuas y tallas de la época muestran a Akhenaton solo, así como en entornos familiares afectuosos que incluían a su consorte principal, Nefertiti, y sus hijos. Tales configuraciones nunca se emplearon en las obras de arte de los faraones antes o después de Akhenaton. & # 8221

Sin embargo, Akhenaton realmente no creía en el monoteísmo, estaba absolutamente convencido de que existían otros dioses, pero decidió que toda la adoración y las oraciones se entregarían a un solo Dios, Atón (el Dios Sol en la tradición del antiguo Egipto). Su período de gobierno se conoce como el período de Amarna. También trasladó la capital de Egipto de Tebas a la ciudad que fundó, conocida como Tell el-Amarna (o Amarna). Este período es el período más debatido y estudiado de la historia de Egipto.

Akhenaton y la familia real bendecidos por Aten Crédito de la imagen: por Troels Myrup

Estudio de ADN del faraón

Todo en Akhenaton era inusual, incluso su ADN.

En 2015, Stuart Fleischmann, profesor asistente de genómica comparada en la Universidad de El Cairo y su equipo publicaron el resultado de un estudio de 7 años. Mapearon los genomas de nueve antiguos faraones egipcios. Ocho muestras eran completamente normales y la novena que pertenecía a Akhenaton era bastante inusual.

& # 8220Fleischmann y su equipo sometieron las preciosas muestras de ADN antiguo a un proceso llamado reacción en cadena polimerasa (PCR). En el campo de la biología molecular, esta técnica se usa a menudo para replicar y amplificar una sola copia de un fragmento de ADN, lo que brinda a los investigadores una imagen clara de la huella genética de una persona.

Ocho de las nueve muestras arrojaron resultados interesantes pero típicos. La novena muestra pertenecía a Akhenaton, el enigmático faraón del siglo XIV a. C. y padre de Tutankamón. Un pequeño fragmento de tejido cerebral desecado había sido la fuente de la muestra de ADN y la prueba se repitió utilizando tejido óseo, pero se obtuvieron los mismos resultados.

Uno de los culpables fue un gen llamado CXPAC-5, responsable del crecimiento de la corteza. La anomalía es visible en la imagen de abajo. & # 8221

Crédito de la imagen: Abovetopsecret

& # 8220 Otra evidencia interesante respalda esta hipótesis. La siguiente imagen muestra dos fotografías de microscopio de tejido óseo extraído del cráneo de Akhenaton y el de una momia diferente de la misma edad. & # 8221

Crédito de la imagen: Abovetopsecret

El cráneo se agranda solo por dos procesos: envejecimiento extremo y mutación genética extrema, por lo que Akhenaton no podría tener más de 45 años. La evidencia arqueológica refuta esto. Además, los microscopios electrónicos han encontrado signos de una cicatriz de nucleón, que es una manifestación segura de la curación de la hélice de ADN después de la exposición a fuertes mutágenos.

Irwin M. Braverman en la 14a Conferencia Histórica Anual Clínicopatológica

Según el profesor de Yale Irwin M. Braverman, la anomalía en la apariencia de Akhenaton podría ser ginecomastia familiar y craneosinostosis. La ginecomastia es la afección que se encuentra principalmente en hombres cuyo pecho se hinchó debido a un desequilibrio hormonal. Braveman dijo que el padre, el abuelo y el bisabuelo de Akhenaton tenían ginecomastia familiar. El agrandamiento de la cabeza de Akhenaton se debió a una afección llamada craneosinostosis.

Los resultados del análisis de tejido óseo tomado del cráneo de Akhenaton mostraron que los huesos del cráneo son mucho más densos y fundamentalmente diferentes de otras momias de la misma edad y período. Además, el cráneo y el esqueleto de Akhenaton son dos veces más densos y duraderos que los de los humanos modernos.

Entonces, ¿quién o qué era Akhenaton en realidad: un híbrido de un extraterrestre, un mutante o una criatura de otro planeta? Si alguno de estos es cierto, entonces existe la posibilidad de que los extraterrestres antiguos llegaran a la Tierra en un pasado distante, residieran cerca del río Nilo y vivieran entre los lugareños.


PALEOBOTANÍA | ADN de plantas antiguas

Problemas asociados con la degradación del ADN

La degradación del ADN presenta varios problemas para el campo del ADNa (cf. Gilbert et al., 2005). Primero, los investigadores están limitados en cuanto a las cantidades de ADN amplificable que pueden recuperar. En segundo lugar, debido a la fragmentación y la reticulación del ADN, los investigadores a menudo tienen una capacidad limitada para amplificar plantillas de menos de unos pocos cientos de pb de tamaño (cf. Willerslev y Cooper, 2005). Cuando esto se combina con los conocimientos sobre las implicaciones de la abundancia relativa de diferentes objetivos genéticos, se hace evidente que existen limitaciones sobre lo que se puede lograr en este campo de estudio. Otro problema, y ​​uno de los más graves para la credibilidad de la disciplina, es el de la contaminación de las muestras. La baja abundancia de ADN extraído de una muestra degradada puede ser fácilmente enmascarada por el ADN moderno de contaminantes externos de la misma secuencia de ADN o de una similar. Sin el tratamiento adecuado para eliminar el ADN ambiental, es una cuestión muy simple (y, desafortunadamente, común) coamplificar ambas fuentes de ADN. Dependiendo de las concentraciones relativas de ADN del huésped al contaminante en la PCR, el ADN diana puede estar completamente saturado o suficientemente modificado para dar lugar a datos erróneos.


Resultados

Siguiendo un panel diverso de loci a través de la preparación de la biblioteca de Illumina

El protocolo de preparación de la biblioteca de Illumina es un proceso de varios pasos que consta de cizallamiento del ADN de entrada, reparación enzimática del extremo, 5'-fosforilación y extensión 3'-single-dA de los fragmentos resultantes, ligadura del adaptador, fraccionamiento por tamaño en un gel de agarosa y Amplificación por PCR de fragmentos ligados al adaptador. El sesgo se puede introducir potencialmente en cualquier paso, incluidos los pasos de limpieza física que eliminan proteínas, nucleótidos y pequeños fragmentos de ADN.

Dado que prácticamente todos los genomas tienen su composición de base en un rango estrecho de% de GC, utilizamos una muestra de ADN genómico compuesta con un rango de composición de base que abarca casi todo el espectro como sustrato de prueba a lo largo de nuestra investigación de las fuentes de sesgo. Comenzamos con una mezcla equimolar de ADN preparada a partir de Plasmodium falciparum (tamaño del genoma 23 Mb, contenido de GC 19%), Escherichia coli (4,6 Mb 51% GC) y Rhodobacter sphaeroides (4,6 Mb, 69% GC). El genoma compuesto de 32 Mb 'PER' es aproximadamente 100 veces más pequeño que un genoma de mamífero típico, lo que lo convierte en un tamaño más manejable para nuestros análisis. Un histograma del% de distribución de GC de ventanas de 50 pb en los tres genomas se muestra en la Figura S1 en el archivo adicional 1.

A continuación, desarrollamos un panel de ensayos de qPCR que definen amplicones que van desde el 6% al 90% de GC (Tabla S1 en el archivo adicional 2). Los amplicones eran muy cortos (50 a 69 pb) y, por lo tanto, nos permitieron realizar ensayos de qPCR en ADN 'PER' cizallado y en alícuotas extraídas en varios puntos a lo largo del protocolo (Figura 1). Determinamos la abundancia de cada locus en relación con una curva estándar de entrada de ADN 'PER'. Para ajustar las diferencias en la concentración de ADN, normalizamos las cantidades calculadas en relación con la cantidad promedio de amplicones de GC al 48% y GC al 52% en cada muestra.

Seguimiento de un panel diverso de loci a través de la preparación de la biblioteca de Illumina. (a-e) En cinco pasos en el protocolo estándar, se retiraron alícuotas y se analizaron para determinar el sesgo de composición de base mediante qPCR. (f, g) Para aislar y analizar la población de fragmentos de ADN competente para la ligación, se realizó una reacción de ligación separada con adaptadores biotinilados seguida de la captura de estreptavidina de los fragmentos que llevaban al menos un adaptador. La cantidad de cada amplicón en una muestra dada se dividió por la cantidad media de los dos amplicones más cercana al 50% de GC. Las abundancias relativas resultantes de amplicones se trazaron en un registro10 escalar sobre sus respectivos contenidos de GC.

El ADN genómico de entrada 'PER' es imparcial por definición. Como se esperaba, un gráfico de dispersión de la cantidad normalizada de cada amplicón sobre su contenido de GC fue esencialmente plano desde el 6% al 90% de GC cuando se trazó en una escala logarítmica, validando el ensayo de sesgo basado en qPCR (Figura 1a). El cizallamiento del ADN no condujo a ningún sesgo obvio de la composición de la base (Figura 1b), ni tampoco los tres pasos posteriores de la reacción enzimática hasta la ligadura del adaptador (Figura 1c). Esto no es sorprendente, ya que hasta este momento no se había llevado a cabo ningún paso explícito de fraccionamiento del ADN además de los pasos de limpieza. El análisis de la mezcla de ligación de fragmentos ligados al adaptador por qPCR no revelaría un sesgo potencial durante ninguna de las reacciones enzimáticas necesarias para ligar el adaptador a los fragmentos de ADN cortados porque la mezcla presumiblemente incluye algunos fragmentos sin adaptador.

Para realizar un ensayo de sesgo exclusivamente en la fracción ligada al adaptador, establecimos una ligación con adaptadores biotinilados no fosforilados, aislamos los fragmentos de ADN ligados al adaptador mediante captura de estreptavidina y liberamos los fragmentos de inserción capturados por desnaturalización para su análisis por qPCR. Vimos muy poco, si acaso, sesgo de GC sistemático en la fracción ligada al adaptador (Figura 1f, g) y, por lo tanto, no hay evidencia de una fuerte discriminación basada en la composición de la base durante cualquiera de las reacciones enzimáticas anteriores y los pasos de limpieza.

La escisión de un rango de tamaño estrecho (correspondiente a aproximadamente 170 a 190 pb de fragmentos genómicos) de un gel de agarosa preparativo no sesgó la composición de base (Figura 1d). Sin embargo, tan solo diez ciclos de PCR utilizando la formulación enzimática (Phusion HF ADN polimerasa) y las condiciones de termociclado prescritas en el protocolo estándar de Illumina agotaron los loci con un contenido de GC & gt del 65% a aproximadamente una centésima parte de los loci de referencia de GC medio (Figura 1e ). Los amplicones & lt 12% GC se redujeron a aproximadamente una décima parte de su nivel de preamplificación. Entre los flancos escarpados a ambos lados, la gráfica de sesgo de GC era esencialmente plana. Su fase de meseta (definida como el segmento en el eje% GC con no más de un punto de datos por debajo de una abundancia relativa de 0,7) osciló entre el 11% y el 56% GC.

Comparación de tres termocicladores a sus velocidades de rampa predeterminadas

Los protocolos de PCR publicados por los fabricantes de kits o en la literatura científica generalmente especifican la temperatura y el tiempo de duración de cada paso de termociclado (por ejemplo, 10 sa 98 ° C para el paso de desnaturalización durante cada ciclo para el enriquecimiento de PCR de las bibliotecas de Illumina) pero rara vez el la velocidad de rampa de temperatura o la marca y modelo del termociclador. Para el experimento que se muestra en la Figura 1 (y para una réplica del experimento que se muestra en la Figura 2, línea roja brillante), usamos las velocidades de calentamiento y enfriamiento predeterminadas (6 ° C / sy 4.5 ° C / s, respectivamente) en el termociclador 1 ( ver Materiales y métodos para la marca y el modelo).

Efecto de las rampas de temperatura. El protocolo de PCR estándar con la ADN polimerasa Phusion HF y los tiempos de desnaturalización inicial (30 s) y en el ciclo (10 s) cortos se realizó en tres termocicladores diferentes en sus respectivos ajustes de rampa de temperatura predeterminados. Las velocidades de calentamiento y enfriamiento fueron 6 ° C / sy 4.5 ° C / s en el termociclador 1 (línea roja brillante), 4 ° C / sy 3 ° C / s en el termociclador 2 (línea púrpura) y 2.2 ° C / sy 2,2 ° C / s en termociclador 3 (línea roja oscura).

La ejecución del protocolo de PCR en el termociclador 2 (a sus velocidades predeterminadas de calentamiento y enfriamiento de 4 ° C / sy 3 ° C / s, respectivamente) extendió la meseta al 76% de GC (Figura 2, púrpura). Thermocyler 3 tenía la velocidad de rampa predeterminada más lenta (2,2 ° C / s). Su gráfico de sesgo fue plano desde el 13% al 84% de GC antes de descender a una décima parte del nivel para los dos loci más ricos en GC (Figura 2, rojo oscuro). Estos resultados son consistentes con la noción de que un termoperfil demasiado empinado no deja suficiente tiempo por encima de una temperatura umbral crítica, lo que provoca una desnaturalización incompleta y una mala amplificación de la fracción rica en GC.

Optimización de las condiciones de PCR

Para desarrollar un protocolo robusto que produzca resultados consistentes en una amplia gama de velocidades de rampa y termocicladores, elegimos optimizar las condiciones de reacción en el termociclador 1, el de peor desempeño, a su velocidad de rampa rápida predeterminada. Razonamos que un protocolo que funciona bien en esta máquina también funcionaría en un termociclador de rampa más lenta.

Simplemente extendiendo el paso de desnaturalización inicial (de 30 sa 3 minutos) y el paso de desnaturalización durante cada ciclo (de 10 sa 80 s) superó los efectos perjudiciales de la velocidad de rampa demasiado rápida, aunque sin restaurar completamente la fracción de GC extremadamente alta (Figura 3a, cuadrados de color rojo oscuro). La desnaturalización prolongada produjo una biblioteca de calidad similar a la desnaturalización más corta en el termociclador 3 de rampa lenta (Figura 2, rojo oscuro).

Optimización de las condiciones de PCR. (a) Ni extender los tiempos de desnaturalización (cuadrados rojo oscuro) ni agregar betaína 2M (triángulos negros) es suficiente para recuperar fragmentos de ADN extremadamente ricos en GC mediante PCR con Phusion HF. (B) La combinación de desnaturalización prolongada y betaína 2M es eficaz para la fracción de GC alta (triángulos negros), pero el perfil no es tan uniforme en todo el espectro de GC como después de la PCR con AccuPrime Taq HiFi (diamantes azules) utilizando tiempos de desnaturalización prolongados y una temperatura más baja ( 65 ° C) para el recocido y la extensión del cebador.

La adición de betaína 2 M sin cambiar el termoperfil tuvo un efecto equivalente en fragmentos de GC moderadamente altos, pero condujo a una ligera depresión de los loci en el rango de GC del 10% al 40% (Figura 3a, triángulos negros). La adición de betaína 2M y la extensión de los tiempos de desnaturalización rescataron, de hecho, ligeramente sobrerrepresentados, loci en el extremo superior del espectro de GC a expensas de los fragmentos de GC baja (Figura 3b, triángulos negros), desplazando la meseta hacia la derecha ( 23 a 90% GC).

Sustituyendo Phusion HF con la mezcla AccuPrime Taq HiFi de ADN polimerasas y ajustando el termoperfil, específicamente prolongando el paso de desnaturalización y bajando la temperatura para el apareamiento del cebador y la extensión de 72 ° C a 65 ° C, obtuvimos el sesgo de GC. perfil que se muestra en la Figura 3b (diamantes azules). Estas condiciones restauraron los loci de GC extremadamente altos casi por completo mientras evitaban la supresión de amplicones de GC moderadamente bajos observados con Phusion HF y betaína 2M (triángulos negros). La meseta osciló entre el 11% y el 84% de GC con solo una ligera caída por encima. Bajar la temperatura para la extensión aún más (a 60 ° C) cambió el equilibrio ligeramente a favor de los loci ricos en AT a expensas de los ricos en GC (ver más abajo).

Realizamos una comparación lado a lado del protocolo AccuPrime Taq HiFi PCR en el termociclador 1 de rampa más rápida y en el termociclador 3 de rampa más lenta y encontramos pocas, si las hay, diferencias en las curvas de sesgo de GC (Figura S2a en Adicional archivo 1). También lo probamos en bibliotecas de fragmentos ligados al adaptador que se habían cortado y seleccionado por tamaño a aproximadamente 360 ​​pb en lugar de inserciones de 180 pb. Los perfiles de GC de las bibliotecas de insertos más grandes amplificados por PCR eran casi tan planos como los de una biblioteca de control de insertos pequeños amplificada en paralelo, con un hombro ligeramente más redondo, alcanzando la fase plana al 17% en lugar del 13% de GC (Figura S2b en Archivo adicional 1).

Comparación directa de la biblioteca de fragmentos y las lecturas de secuenciación

El ensayo qPCR mide la composición de la biblioteca amplificada por PCR. Es probable que los pasos posteriores como la amplificación de grupos, la secuenciación por síntesis, el análisis de imágenes y el procesamiento de datos fuera del instrumento también introduzcan sesgos. Para comparar directamente las bibliotecas de entrada y los datos de salida finales, es decir, las lecturas de Illumina alineadas y filtradas por calidad, secuenciamos cuatro bibliotecas de fragmentos de 400 pb para las que también teníamos datos de qPCR y contamos las lecturas de secuenciación que cubren los mismos loci.

Como se muestra en la Figura 4, para una biblioteca amplificada con AccuPrime Taq HiFi utilizando 60 ° C para el paso de extensión del cebador, los perfiles de secuenciación y qPCR GC se siguen de cerca, incluidos algunos de los pronunciados altibajos que pueden reflejar rasgos de amplificación de loci individuales , como el contexto de secuencia o el potencial de formación de horquilla, no capturado en su contenido de GC promedio indicado en el eje x. Una superposición de qPCR y datos de secuenciación para tres bibliotecas amplificadas de manera diferente está disponible en la Figura S3 en el archivo adicional 1.

Comparación de datos de secuenciación de salida y biblioteca de entrada. Se muestra la abundancia relativa de loci en la biblioteca determinada por qPCR (púrpura) y la abundancia relativa de lecturas de secuenciación de Illumina que cubren estos loci en un carril de datos de Hi-Seq (negro). Ambos conjuntos de datos se normalizaron al promedio de los dos loci más cercanos al 50% de GC.

Observamos algunos valores atípicos. Por ejemplo, los amplicones con aproximadamente un 70% o un 80% de GC recibieron menos cobertura de secuencia que sus vecinos en el% de espacio de GC, a pesar de la abundancia relativamente alta en la biblioteca. Un examen detallado de amplicones & gt 50% GC sugirió un efecto del contexto de la secuencia. Encontramos que el% GC de una ventana de 250 pb centrada en los amplicones es un mejor predictor de subcobertura que el% GC de los amplicones propiamente dichos (Figura S4 en el archivo adicional 1). La caída sistemática en la cobertura de la secuencia con el aumento del contenido de GC no fue causada por una subrepresentación proporcional de loci de alto GC en la biblioteca, lo que indica que existe un sesgo aguas abajo de la preparación de la biblioteca.

Cobertura de secuencia de todo el genoma

Nuestros loci de prueba, que habían sido seleccionados en parte basándose en su capacidad para ser amplificados por PCR, pueden o no ser verdaderos representantes de sus respectivas composiciones de bases en general. Para medir el sesgo de secuenciación en todo el genoma, calculamos la proporción promedio de cobertura observada y esperada (insesgada) para ventanas deslizantes de 50 pb. La superposición de datos de sesgo de loci específicos y de todo el genoma, cada uno normalizado en relación con la fracción de GC media (48 a 52%), mostró que los loci seleccionados eran, en general, buenos proxies para sus respectivas categorías de% GC, a pesar de las distintas Comportamiento de amplificación de los loci individuales (Figura S5 en el archivo adicional 1).

El estándar Phusion HF PCR (desnaturalización corta y rampa rápida) redujo las secuencias & gt 70% GC a menos de una centésima parte de las ventanas de referencia de GC medio (Figura 5, cuadrados rojos). La adición de betaína y la prolongación del paso de desnaturalización rescataron la fracción de GC alta de manera eficiente y completa (Figura 5, triángulos negros): ventanas de 50 pb con hasta 94% de GC todavía recibieron más de la mitad de la cobertura media de aquellas con aproximadamente 50% de GC, demostrando que se pueden secuenciar tramos de 50 bases que consisten casi en su totalidad en Gs y Cs, siempre que estén presentes en la biblioteca. Sin embargo, esta ganancia de secuencias de alta GC se produjo a expensas de las secuencias de alta AT, que sufrieron una pérdida significativa en comparación con la biblioteca estándar de Phusion HF.

Curvas de sesgo de composición de base de todo el genoma 'PER'. (a, b) Se muestra el sesgo de GC en las lecturas de Illumina de una biblioteca de fragmentos de 400 pb amplificada mediante el protocolo de PCR estándar (Phusion HF, desnaturalización corta) en un termociclador de aceleración rápida (cuadrados rojos), Phusion HF con desnaturalización larga y betaína 2M (triángulos negros ), AccuPrime Taq HiFi con desnaturalización prolongada y extensión de imprimación a 65 ° C (diamantes azules) o 60 ° C (diamantes violetas). Para calcular la cobertura de lectura observada a esperada (insesgada), el número de lecturas que se alinean con ventanas de 50 pb en un% de GC dado se dividió por el número de ventanas de 50 pb que caen en esta categoría de% de GC. Luego, este valor se normalizó en relación con el valor promedio de 48% a 52% GC y se representó en un registro10 escala (a) o escala lineal (b).

De acuerdo con los datos de qPCR, las bibliotecas amplificadas con AccuPrime Taq HiFi estaban menos sesgadas que las bibliotecas amplificadas con Phusion. La extensión del cebador recocido con AccuPrime Taq HiFi a 65 ° C (Figura 5, diamantes azules) superó ambas reacciones de Phusion en el extremo de GC bajo mientras retuvo la fracción de GC alto casi tan bien como Phusion con betaína (Figura 5, triángulos negros) . Bajar la temperatura de extensión a 60 ° C (Figura 5, diamantes púrpuras) devolvió incluso más secuencias de GC bajas mientras que disminuyó un poco el rendimiento de lecturas ricas en GC. La extensión a 60 ° C produjo una biblioteca amplificada en la que todos los contenedores de ventanas de 50 pb entre el 2% y el 96% de GC recibieron al menos una décima parte de la cobertura promedio de la referencia de GC medio.

Ningún protocolo de PCR único fue ideal. El mejor protocolo para GC alto, Phusion HF con betaína, condujo a una representación deficiente de loci de AT alto. El protocolo que funcionó mejor para AT alta, AccuPrime Taq HiFi con extensión del cebador a 60 ° C, comprometió la fracción de GC alta. Un grupo de dos bibliotecas amplificadas de manera diferente sería más complejo que cualquiera de las bibliotecas por sí solo, pero también agregaría costos al duplicar la cantidad de construcción de bibliotecas requerida. Todavía estaría sesgado y, cuando se secuencia, producir un perfil de sesgo de GC intermedio similar a los que se muestran en la Figura S6 en el archivo adicional 1 que se generaron al agrupar las lecturas de secuenciación.

También calculamos la fracción del genoma que recibió menos de una décima parte de la cobertura media de todo el genoma (Tabla 1). Según esta medida, AccuPrime Taq HiFi PCR con extensión del cebador a 60 ° C fue claramente la mejor condición de amplificación para los ricos en AT. P. falciparum genoma, y ​​en general, para el genoma compuesto 'PER', el 71% del cual consiste en P. falciparum ADN. This method was slightly worse than the 65°C extension protocol for the GC-rich R. sphaeroides genome, for which long-denaturation PCR with Phusion in the presence of betaine came out on top. los E. coli genome was very evenly covered by three conditions. Only the standard PCR protocol with Phusion HF and short denaturation, when performed with an overly fast temperature ramp, left more than 0.5% of the E. coli genome under-covered.

Rescuing GC-rich loci in the human genome

To test if our optimized conditions improve the representation of biologically relevant loci in the human genome, we developed qPCR assays for eight GC-rich loci near gene promoters and four size-matched control loci. All eight test loci had been under-represented in previous sequencing runs with standard PCR-amplified libraries. We amplified a fragment library of human DNA on the fast-ramping thermocycler 1 using the standard Phusion and the AccuPrime Taq HiFi (extension at 65°C) protocols. The first protein-coding exon of the tumor suppressor gene RB1 was below the detection limit in the standard library (Figure 6a) and near unity (109% of the average of the four control loci) in the improved library (Figure 6b). The mean relative abundance of all eight test loci rose from 3% (range 0 to 11%) to 116% (range 60 to 153%).

Optimized PCR conditions rescue GC-rich promoter regions in the human genome. (a,b) A 180-bp fragment library of human DNA was amplified using (a) standard conditions (Phusion HF, short denaturation) or (b) optimized conditions (AccuPrime HiFi, long denaturation, extension at 65°C) on the fast-ramping thermocycler 1. The amplified libraries were analyzed by qPCR. Orange bars indicate the quantity of eight GC-rich loci near gene promoters relative to the mean quantity of four size-matched control loci (blue bars mean set to 100% in each graph). Error bars represent the range of two measurements averaged to calculate the quantity of each locus. Locus 7 is the first protein-coding exon of the tumor suppressor gene RB1.

Comparison of PCR-amplified and PCR-free Illumina libraries

Kozarewa et al. [21] developed a protocol for Illumina sequencing without PCR to amplify and enrich adapter-ligated DNA fragments. We sequenced a PCR-amplified and a PCR-free human 180-bp fragment library side-by-side on an Illumina Hi-Seq flowcell and calculated the mean coverage (relative to the mean genome-wide coverage) of a larger set of GC-rich loci (Table S3 in Additional file 2). The 100 test loci were 200 bp in length, located on or near annotated transcription start sites, had a mean GC content of 80% (standard deviation 5%) and were known to be poorly covered in previous whole-genome sequencing runs. By this measure, the PCR-amplified library (AccuPrime Taq HiFi with extension at 65°C) and the PCR-free library performed equally: the mean coverage of the test loci was 28% in both data sets, a 3.6-fold under-representation.

By sequencing the PCR-amplified library, 50-bp windows from 12% to 92% received at least half the mean coverage of those with 50% GC (Figure 7a,b). Only about 0.2% of 50-bp windows in the human reference genome - and less than 0.02% of 50-bp windows that overlap with the human exome - fall outside this range. With the PCR-free library, the mean relative coverage of GC-rich loci stayed near or above unity all the way to 100% GC. The PCR-free library was also slightly better for AT-rich loci, with up to 1.4-fold better coverage of 50-bp stretches containing only one G or C. From 8% to 88% GC, the fold increase by sequencing an unamplified fragment was less than 1.25 (Figure 7c). More than 99.9% of all 50-bp windows in the human genome fall in this category.

Sequencing bias with PCR-amplified and PCR-free libraries. (a,b) Shown is the mean normalized coverage of 50-bp windows in the human genome having the GC-content indicated on the x-axis for a PCR-free (orange dots) and a PCR-amplified (blue diamonds) Illumina sequencing library. Both fragment libraries had approximately 180-bp inserts. The PCR amplification was performed with AccuPrime Taq HiFi (long denat., primer extension at 65°C). The coverage was plotted on a log10 (a) and a linear scale (b). The data points at extremely high GC, where the reads from the PCR-free library had a mean base quality of less than Q20 (open symbols), were omitted in the middle panel (b). (C) The ratios of the two curves in (a,b), that is, the fold-increase in mean coverage by sequencing a PCR-free library instead of a PCR-amplified library. The shaded histogram is the %GC distribution of 50-bp windows in the human genome. More than 99.9% of all 50-bp windows in the genome contain 8% to 88% GC and received a less than 1.25-fold increase in coverage. Less than 0.01% of all 50-bp windows contain 90% or more GC. The open circles at 96% and 98% GC denote data for which the mean base quality of the reads from the PCR-free library was below Q20.

We note that skipping the PCR step during library preparation does not necessarily yield unbiased Illumina sequencing reads, presumably due to bias introduced further downstream in the sequencing process.


Biologics Medicine

6.11.11.3 Oligonucleotide Chromatography Equipment

Unlike ON synthesis that requires highly specialized equipment, which may not be readily available especially at large scales, chromatography systems are more accessible since these systems have wider applications ranging from biopharmaceuticals to small molecules. The key to efficient therapeutic-grade ON purifications therefore lies mostly on the stationary phase, eluent, and conditions used. Equally important is the purification column and column packing strategy employed. Nonetheless, for purification equipment designed for ONs, GE is among the industry leaders with the ÄKTA purification platforms, which complement their synthesizers. Just like in synthesis, GE provides skids from the research-scale (ÄKTA purifier/pure) to large-volume manufacturing (BioProcess/ÄKTAprocess). The ÄKTApurifier and BioProcess have been discontinued and replaced with AKTApure and ÄKTAprocess, respectively. The ÄKTAprocess can deliver flow rates up to 2000 L/h, whereas the UNICORN software makes processes developed on GE’s purification platforms easy to scale up and transfer the systems suffer from their both pressure and low temperature ratings and are not amenable for processes, which require high pressure and sufficient denaturing temperature conditions. Similarly to the equipment, GE’s purification columns are generally designed for low-pressure applications at temperatures below 40°C.

For high pressure and temperature purification equipment, ASAHI KASEI, LEWA, and Novasep are among the major players. For purification columns, Load & Lock stainless columns (Agilent and Agar Machining) have high-pressure dynamic axial compression (DAC) packing, which provides improved bed stability and higher loading. They can also be jacketed for use at higher temperatures.


Métodos

Yeast strain, growth conditions and extraction of total RNA

Total yeast RNA was isolated by a modification of the procedure described previously [11]. Strain W303-1A (Mata, ade2-1, trp1-1, leu2,3-112, his3-11,15, ura3, can1-100) was grown in YPD-supplemented medium (1% yeast extract, 2% bacto peptone, 2% glucose and 0,01% of adenine, uracil, tryptophan, leucine and histidine) in a rotatory shaker (160 rpm and 28°C). Cell growth was monitored by reading OD at 570 nm. Cells (10 mg of dry weight) were harvested by centrifugation and washed with DEPC (diethylpyrocarbonate) treated water at 2200 × g for 5 min before they were resuspended in 0.6 ml RNA extraction buffer (10 mM EDTA (ethylenediaminetetracetic acid), 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1M NaCl, 5% SDS) and 0.6 ml of phenol:chloroform:isoamyl alcohol (50:50:1) mixture. After 6 min at room temperature, 2 g of glass beads (0.45 mm diameter) were added and the cells were broken by vigorous agitation for 2 min on a vortex mix set at maximum speed. The extract was transferred to a microfuge tube (1.5 ml) and cell debris and organic phase were separated from upper aqueous phase by centrifugation at 2200 × g for 5 min (24°C). The upper phase was collected, extracted twice with 1 volume of phenol: chloroform: isoamyl alcohol (50:50:1) and once with 1 volume of chloroform: isoamyl alcohol (24:1). The RNA was precipitated from the last upper aqueous phase by the addition of 0.1 volume of 3M NaOAc, pH 5.2, plus 3 volumes of ice-cold absolute ethanol followed by incubation at -20°C for 1 h. The RNA was pelleted by centrifugation at 15000 × g for 15 min (4°C), washed once with ice-cold 70% ethanol and again pelleted at 15000 × g for 15 min. After the remaining alcohol was allowed to evaporate, the pellet was resuspended in 30 μl of DEPC treated water. Concentration of RNA in the sample was measured by reading OD at 260 nm in a Beckman DU-6 spectrophotometer (1 OD = 42 μg RNA/ml). All materials and solutions were previously treated with DEPC [12].

Removal of contaminating genomic DNA from unfractionated RNA

RNA samples were treated with RNase-free bovine pancreatic DNase I (E.C. 3.1.21.1) to eliminate DNA contamination using two different protocols. Protocol I was a modification of the procedure previously described for C. Botulinum [13]. Six micrograms of RNA, 6.25 mM MgCl2 and 10U of RNase-free DNase I (Sigma) in a 10 μl reaction mixture in water were incubated at 37°C for 30 min. The reaction was stopped by the addition of 2 mM EDTA, pH 8.0, followed by incubation at 37°C for 1 min before inactivation at 65°C for 10 min. RNA was extracted with 1 volume of phenol: chloroform (5:1) and after centrifugation at 2200 × g for 5 min, the RNA present in the upper aqueous phase was precipitated with ice-cold absolute ethanol and collected by centrifugation at 15000 × g for 15 min (4°C). The remaining alcohol was allowed to evaporate and the pellet was resuspended in 30 μl of DEPC treated water. Protocol II was performed using the DNase I amplification grade kit (Life Technologies, Inc.) following the recommended procedure. In brief, 1 μg of RNA was resuspended in 20 mM Tris-HCl pH 8.4 2.0 mM MgCl2 50 mM KCl and 1U of DNase I into a final volume of 10 μl. After incubation for 15 min at room temperature, DNase was inactivated by the addition of 2,2 mM EDTA, pH 8.0, and subsequent incubation at 65°C for 10 min. The product of this reaction was used directly for RT-PCR without further treatment.

RT-PCR assay

mRNAs were amplified by using the kit Ready-to-Go RT-PCR Beads (Amershan Pharmacia Biotech Inc.) in a GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer Inc.). Each reaction contained

2.0U of TaqDNA polimerase, 10 mM Tris-HCl pH 9.0, 60 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 μM of each dNTP, MMuLV reverse transcriptase, RNA guard ribonuclease inhibitor, stabilizer including RNase/DNase free BSA, 1 μg of total RNA and 20 pmol of the appropriate primers (Del Aguila et al, 2003 Souza, 2001) (Table 1) into a final volume of 50 μl. Synthesis of cDNA was performed at 50°C for 20 min and stopped by inactivation of reverse transcriptase at 95°C for 10 min. Amplification of cDNA by PCR was performed for 30 sec at 95°C 30 sec at 65°C and 1 min at 72° C for 30 cycles, chosen after testing amplification from 20 to 40 cycles. RT minus controls was incubated at 95°C for 10 min to inactivate M-MuLV (Moloney murine leukemia virus) reverse transcriptase before cDNA synthesis and PCR steps. RT-PCR products were run on 1.3% agarose gel in 1x TAE (40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA) buffer, pH.8.0, and stained with aqueous ethidium bromide at a concentration of 0.5 μg/mL [12]. Data represent a typical result obtained from three different experiments.


Métodos

Plasmid construction

The nCas9, APOBEC1, UGI, ecTadA, and ecTadA7.10 portions of PBEcs and PABEcs were amplified from PBE or PABE-7 [19, 25]. The Cas9 variant nCas9-NG (D10A) containing the R1335V/L1111R/D1135V/G1218R/E1219F/A1322R/T1337R substitutions was amplified from STEME-NG [41]. Binding proteins, including MCP, PCP, N22p, and Com, were synthesized commercially (GenScript, Nanjing, China). The different components of PBEcs, PABEcs, and SWISSv2/v3 were assembled into the pJIT163 backbone by One Step Cloning (ClonExpress II One Step Cloning Kit, Vazyme, Nanjing, China). The sgRNA constructs pOsU3-sgRNA and pOsU3-esgRNA have been previously described [25] the TaU6 promoter was amplified from pTaU6-sgRNA [25]. All the scRNAs listed in Additional file 2: Sequences S2 were synthesized commercially and used to replace the sgRNA in pOsU3-esgRNA by One Step Cloning. Annealed oligos were inserted into BsaI (New England BioLabs)-digested OsU3-derived vectors. To construct the pH-SWISSv2/v3 binary vector, this cassette was cloned into the pHUE411 backbone under the Ubi-1 promoter of maize [47]. PCR was performed using TransStart FastPfu DNA Polymerase (TransGen Biotech, Beijing, China). All primer sets used in this work were listed in Additional file 1: Table S5 and were synthesized by Beijing Genomics Institute (BGI).

Installing multiple sgRNAs

The templates for assembling multiple sgRNAs listed in Additional file 2: Sequences S4 were synthesized commercially. For dual sgRNAs, the PCR products were amplified from esgRNA-pTaU6 or esgRNA-2×boxB-pTaU6 and installed into pOsU3-esgRNA or pOsU3-esgRNA-2×MS2 by Golden Gate cloning [37]. For triple or quadruple sgRNAs, the PCR products were amplified from single- or dual-sgRNA vectors and assembled by Multi One Step Cloning (ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit, Vazyme, Nanjing, China).

Protoplast transfection

We used the Japonica rice variety Nipponbare to prepare protoplasts. Protoplast isolation and transformation were performed as described [48]. Ten micrograms of each of nuclease and sgRNA plasmid DNA was introduced into the protoplasts by PEG-mediated transfection, with a mean transformation efficiency of 30–45% as measured by flow cytometry (FCM) or hemocytometer. The transfected protoplasts were incubated at 23 °C. The protoplasts were collected after 60 h incubation, and the genomic DNA were extracted for amplicon deep sequencing.

Agrobacterium-mediated transformation of rice callus cells

The binary vector was transformed into A. tumefaciens AGL1 by electroporation and used to transform about 120 rice calli. Agrobacterium-mediated transformation of callus cells of the Japonica rice variety Zhonghua11 was conducted as reported [48]. Hygromycin (50 μg/ml) was used to select transgenic plants.

Extracción de ADN

Genomic DNA of protoplasts was extracted with a DNA-Quick Plant System (Tiangen Biotech, Beijing, China). Genomic DNA of regenerated rice seedlings was extracted with CTAB. Targeted sites were amplified with specific primers, and the amplicons were purified with an EasyPure PCR Purification Kit (TransGen Biotech, Beijing, China) and quantified with a NanoDrop™ 2000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

Amplicon deep sequencing and data analysis

Genomic DNA extracted from the desired protoplast samples at 60 h post-transfection served as template. Two rounds of PCR were performed for the amplicons of protoplasts. In the first round, the target region was amplified using site-specific primers (Additional file 1: Table S5). In the second, both forward and reverse barcodes were added to the ends of the PCR products for library construction (Additional file 1: Table S5). Equal amounts of the PCR products were pooled and purified by Gel DNA Extraction, and samples were sequenced commercially (Novogene, Tianjin, China) using the Illumina NextSeq 500 platform. The protospacer sequences in the reads were examined to identify base substitutions or indels. Amplicon sequencing was performed three times for each target site, using genomic DNA extracted from three independent protoplast samples. Amplicon reads with a quality score < 30 were filtered out. Analyses of base-editing processivity were performed as previously described [49].

Mutant identification by T7EI and Sanger sequencing

Site-specific primers were used to amplify genomic DNA from regenerated rice seedlings. T7EI enzyme (Vazyme, Nanjing, China) was used to identify rice mutants with C-to-T conversions, A to G conversions, or indels in target regions, with an optimized protocol: 200 ng sample PCR products, 200 ng wild-type PCR products, and reaction buffer added to 8.0 μL 98 °C denaturation for 10 min, 95 °C denaturation for 5 min, and temperature lowered from 90 to 10 °C in next 10 steps followed by denaturation for 1 min 0.2 μL T7EI (10 U/μL) added with water to 10.0 μL and incubate at 37 °C for 20 min and assay immediately. Sanger sequencing was performed to confirm genotypes. The genotypes of indels were analyzed with the online tools DSDecodeM [50] and TIDE [51].

Off-target analysis

Potential off-target sites were predicted using the online tool Cas-OFFinder [52]. Sites containing up to 3-nt mismatches were examined. The whole-genome sequencing assay and genome-wide Cas9-independent off-target analysis were conducted as reported [32].

Análisis estadístico

GraphPad Prism version 7.0 was used for all data analysis. All numerical values are presented as means ± s.e.m. Statistical comparison adjustments were performed using two-tailed Mann-Whitney U prueba.


Resultados

Quality indicators in DNA samples isolated from human 118 frozen tissues in OCT, 68 FFPE tissues, 119 frozen blood samples, and 26 saliva samples were analyzed.

The 260/280 purity ratio was obtained for each DNA sample, with the average value between 1.8 and 2.0 for all the groups (Table 1). For DNA extracted from FFPE tissue samples, only a single sample with a ratio out of range was found, as it is represented by the percentage of samples for each group with a purity ratio between 1.6 and 2.0. The 260/230 purity ratio was also determined for each DNA sample and represented versus its corresponding DNA concentration value (Fig. 1). The 260/230 ratio for high-concentration DNA was ∼2.0 for all groups (frozen tissue in OCT [Fig. 1A], FFPE tissue [Fig. 1B], frozen blood [Fig. 1C], and saliva [Fig. 1D]), whereas low-concentration DNA presented a higher 260/230 ratio for frozen tissue and blood samples.

HIGO. 1. DNA purity 260/230 ratio. Absorbance at 260 and 230 nm was measured for each DNA sample isolated from frozen tissue in OCT (A), FFPE tissue (B), frozen blood (C), and saliva (D), and 260/230 ratio obtained was represented versus its corresponding DNA concentration based on spectrophotometric measurement. The trendline for each group of samples is shown. FFPE, formalin-fixed paraffin-embedded OCT, optimal cutting temperature.

Table 1. DNA Purity 260/280 Ratio

Absorbance at 260 and 280 nm was measured for each DNA sample isolated from frozen tissue in OCT, FFPE tissue, frozen blood, and saliva, and the purity of the DNA was calculated using 260/280 ratio. The average 260/280 ratio and standard deviation for each type of source of DNA are shown. Since an optimum value for 260/280 ratio for pure DNA is 1.8, the percentage of samples for each group with a purity ratio between 1.6 and 2.0 was determined (in parentheses). Only for FFPE tissue, we found a single DNA sample with a 260/280 ratio out of range (2.1).

FFPE, formalin-fixed paraffin-embedded OCT, optimal cutting temperature.

Next, we observed the integrity for DNA samples from frozen tissue in OCT, FFPE tissue, frozen blood, and saliva by electrophoresis on an agarose gel (Fig. 2), and we estimated the ratio between the HMW band higher than 20 kb and the smear using densitometry analysis (Table 2). The percentage of DNA samples with presence of the HMW band was also determined. DNA integrity for all the groups of samples was high as the percentage near 100% indicated, except for DNA samples isolated from FFPE tissue, which were observed as a smeared band and the HMW band was not observed. Densitometric measurements supported the integrity results as the HMW band/smear ratio was considerably higher than 1.0 for frozen tissue and blood samples and lower than 1.0 for FFPE tissues. The ratio for saliva samples was 1.31 because of the lower intensity of the HMW band.

HIGO. 2. DNA integrity observation by electrophoresis in agarose gel. DNA samples were analyzed by loading 50 ng of DNA on a 0.8% agarose gel. The Lambda-pUC Mix Marker 4 (MW) was also separated as size reference. Four representative samples of DNA for frozen tissue in OCT (A), FFPE tissue (B), frozen blood (C), and saliva (D) are shown.

Table 2. DNA Integrity Analysis by Agarose Gel Electrophoresis

The extracted DNA samples from frozen tissue in OCT, FFPE tissue, frozen blood, and saliva were evaluated by loading 50 ng of DNA on a 0.8% agarose gel electrophoresis. Densitometry analysis was performed to gauge the ratio between the HMW band higher than 20 kb and the smear. The average ratio and standard deviation for each type of source of DNA are shown. The percentage of samples for each group with presence of a HMW band was also determined (in parentheses).

HMW, high molecular weight.

When DNA integrity was estimated using the ratio between both absolute yields by PicoGreen and by spectrophotometry, results corroborated the higher integrity for DNA samples from frozen tissue, blood, and saliva with trend values of 1.0, and the lower integrity for DNA from FFPE tissue. However, the ratio for blood was lower than that we expected from agarose gel results (Fig. 3).

HIGO. 3. PicoGreen ® /A260 yield ratio. PicoGreen DNA quantification and DNA quantification using Lambert–Beer law from 260 nm absorbance were performed for each DNA sample isolated from frozen tissue in OCT (A), FFPE tissue (B), frozen blood (C), and saliva (D). Absolute yields in micrograms of DNA obtained for both methods were calculated. The average ratio and standard deviation of the ratio between absolute yield using PicoGreen and spectrophotometry for each type of source are represented.

To determine the usability of DNA samples for downstream applications, a real-time PCR assay for the GAPDH y RPLP0 genes was performed. Although all DNA samples amplified for both genes, the CT value for FFPE tissue was significantly higher (almost five cycles) (Fig. 4), supporting the higher fragmentation of DNA.

HIGO. 4. DNA performance for real-time PCR assay. Fifteen randomized DNA samples isolated from frozen tissue in OCT (A), FFPE tissue (B), frozen blood (C), and saliva (D) were amplified by real-time PCR for the GAPDH (izquierda) y RPLP0 (Derecha) genes. The average CT value and standard deviation for each type of source were calculated. PCR, polymerase chain reaction.

In fact, when different sized PCR products were amplified (5049, 1137, and 400 bp corresponding to ACVR2B, ZFX, AF4 genes, respectively), DNA from FFPE tissue failed to amplify the 400 bp product (Fig. 5). Only frozen tissue in OCT and blood were able to amplify all the products.

HIGO. 5. DNA quality for PCR analysis. Fifteen randomized DNA samples isolated from frozen tissue in OCT (A), FFPE tissue (B), frozen blood (C), and saliva (D) were amplified by PCR for the ACVR2B, ZFX, AF4, y GAPDH genes. PCR products of 5049, 1137, 400, and 87 bp, respectively, were analyzed by agarose gel electrophoresis. Four representative samples for each group are shown.


Affibody-mediated hot-start PCR enzyme with improved speed, yields, and amplicons length

Thermo Scientific Phire Hot Start II DNA Polymerase is fused with a dsDNA-binding domain that allows short extension times (10–15 sec/kb) and helps improve yields compared to a standard hot-start Taq DNA polymerase. In addition, its hot-start technology with Affibody molecules allows complete activation of the enzyme in “zero-time” at standard cycling temperatures. This combination of features, along with 2x fidelity of Taq DNA polymerase, makes Phire Hot Start II DNA Polymerase an ideal solution for routine and high-throughput PCR applications.

Características:

  • Fast enzyme with quick hot start (no separate activation step required)
  • Minimal reaction optimization due to high inhibitor tolerance and amplicons length than with traditional hot-start Taq ADN polimerasa
  • Direct gel loading of PCR products, with green reaction buffer formats

Complete PCR cycling in less than half the time

Phire Hot Start II DNA Polymerase provides extension time of 10 sec/kb, requires no separate activation step, and allows direct loading of PCR products onto gels. Due to these features, PCR protocols with Phire Hot Start II DNA Polymerase is significantly faster than protocols with Taq DNA polymerases.

Short cycling times with Phire Hot Start II DNA Polymerase. A 600 bp fragment from human genomic DNA was amplified with five different hot-start DNA polymerases. With Phire Hot Start II DNA Polymerase, the PCR protocol was completed up to four times faster than with Taq DNA polymerases utilizing chemical or antibody-based hot-start technologies (suppliers A-D). Green buffer further reduces experimental time by allowing fewer pipetting steps and direct gel loading.


Scientists discover a way to sequence DNA of rare animals

Rare and extinct animals are preserved in jars of alcohol in natural history museum collections around the world, which provide a wealth of information on the changing biodiversity of the planet. These preserved specimens of snakes, lizards, frogs, fish and other animals can last up to 500 years when processed in a chemical called formalin. While formalin helps preserve the specimen making it rigid and durable, it poses a challenge to extracting and sequencing DNA. Furthermore, DNA degrades and splits into small fragments over time. This fragmented DNA is difficult to amplify into long informative stretches of DNA that can be used to examine evolutionary relationships among species when using older DNA sequencing technology. Therefore, scientists have not been able to effectively sequence DNA from these specimens until now.

LSU Museum of Natural Science Curator and Professor Christopher Austin and his collaborator Rutgers-Newark Assistant Professor Sara Ruane developed a protocol and tested a method for DNA sequencing thousands of genes from these intractable snake specimens. Their research was published today in the international scientific journal Molecular Ecology Resources.

"Natural history museums are repositories for extinct species. Unfortunately, naturalists in the 1800s were not collecting specimens for analyses we conduct today such as DNA sequencing. Now with these new methods, we can get the DNA from these very old specimens and sequence extinct species like the Ivory Billed Woodpecker, the Tasmanian Wolf and the Dodo Bird," Austin said.

He and Ruane found and tested an approach that includes taking a small piece of liver tissue from the snake specimen, heating it up over a longer period of time and applying an enzyme that digests the tissue sample and enables the DNA to be extracted. Their minimally invasive protocol preserves the specimen so additional information can be collected from the specimen in the future. It also includes applying the latest technology to chemically sequence the specimens' DNA.

"A genome is a complex jigsaw puzzle broken up in to hundreds of millions of small pieces. We can sequence those pieces and computationally put them back together," Austin said.

They extracted and sequenced the DNA of 13 historic or rare snake specimens from all over the world many of which had never been analyzed using modern genetic methods. Some of the specimens were more than 100 years old. They also integrated these data with modern samples to create a genetic family tree, or phylogeny, that maps the evolutionary relationships of various snake species. This work resulted in thousands of genetic markers for snake specimens collected as far back as the early 1900s.

"The exciting thing about this work is that it makes species that have been essentially lost to science, due to extirpation, rarity or general secretiveness, which applies to many animals and not just snakes, available for scientific research in the modern age of genomics," Ruane said.

"We also believe this research will benefit scientists working with rare animals that are either hard to collect or extinct but are represented in fluid-preserved historical collections. It also underscores the continued importance of museum collections in modern science," Austin said.


Ver el vídeo: Clonación de ADN y ADN recombinante. Biología. Khan Academy en Español (Junio 2022).


Comentarios:

  1. Darwin

    un mensaje encantador

  2. Zulkit

    Lo siento, descarté esta pregunta.

  3. Harb

    Lo siento, pero en mi opinión, estás equivocado. Puedo demostrarlo. Escríbeme en PM, discúblalo.



Escribe un mensaje