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Al restar el fondo de una imagen de transferencia Western, ¿el método de sustraer la señal de fondo tiene que ser el mismo para todas las transferencias analizadas?

Al restar el fondo de una imagen de transferencia Western, ¿el método de sustraer la señal de fondo tiene que ser el mismo para todas las transferencias analizadas?


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Estoy analizando algunas imágenes de Western blot y quiero restar la señal de fondo de mis bandas de proteínas de interés. Anteriormente, la forma en que restaba el fondo era dibujar un rectángulo (que era la misma área que el rectángulo que delinea mi banda de proteína de interés) en la parte superior de cada carril, y restar la densidad integrada de este rectángulo de fondo de la densidad integrada de mi banda de proteínas.

Sin embargo, he leído un artículo sobre diferentes métodos para restar el fondo de una imagen de western blot. En el documento dice: "El área (generalmente un rectángulo) que se usa para la resta de fondo generalmente se coloca por encima o por debajo o es un promedio de la intensidad del área por encima o por debajo de la banda de interés".

Sin embargo, para una mancha que tengo, el fondo en el área debajo de mis bandas de proteína objetivo es mucho más alto en comparación con el fondo en el área por encima de las bandas.

Para esta mancha, estoy considerando dibujar 2 rectángulos de fondo, uno arriba y abajo de las bandas de proteína, y tomar el promedio de su densidad integrada.

Creo que este método me daría una medida más precisa del fondo en comparación con dibujar un solo rectángulo en la parte superior del carril.

Dado que solo tengo este problema de fondo desigual (donde el fondo es mucho más alto en la mitad inferior de la mancha que en la parte superior) para una imagen de mancha, no creo que sea necesario usar dos rectángulos de fondo para las otras manchas .

Estoy analizando imágenes de muchas manchas, en las que he etiquetado para una variedad de proteínas. Me pregunto si la forma en que resto el fondo de cada imagen borrosa tiene que ser la misma. ¿O está bien usar diferentes métodos de sustracción de fondo dependiendo de la situación de fondo única para cada mancha?

Se agradece cualquier información.


Western blot con resolución de celda única

Este protocolo describe cómo realizar Western Blot en células individuales para medir la variación de célula a célula en los niveles de expresión de proteínas y el estado de las proteínas. Al igual que el western blot convencional, el western blot de una sola célula (scWB) es particularmente útil para dianas proteicas que carecen de anticuerpos selectivos (p. Ej., Isoformas) y en los casos en los que la señal de fondo de las células intactas es confusa. scWB se realiza en un microdispositivo que comprende una serie de micropocillos moldeados en una capa delgada de un gel de poliacrilamida (PAG). La capa de gel funciona como una matriz de tamizado molecular durante la PAGE y como un andamio de transferencia durante la inmuno-sonda. scWB implica cinco etapas principales: (i) sedimentación por gravedad de las células en micropocillos (ii) lisis química de las células en cada micropocillo (iii) PAGE de cada lisado de una sola célula (iv) exposición del gel a la luz ultravioleta para borrar (inmovilizar) proteínas a la matriz de gel y (v) inmuno-sonda en gel de proteínas inmovilizadas. La multiplexación se puede lograr probando con cócteles de anticuerpos y utilizando técnicas de eliminación / reprobación de anticuerpos, lo que permite la detección de más de 10 proteínas en cada célula. También describimos la fabricación de microdispositivos para microgeles uniformes y de gradiente de poros. Para extender la inmuno-sonda en gel a geles de tamaño de poro pequeño, describimos un protocolo de des-reticulación de gel opcional para una introducción más efectiva de anticuerpos en la capa de gel. Una vez que se ha fabricado el microdispositivo, los principiantes en microfluidos pueden completar el ensayo en 4-6 h y genera datos multiplexados de alta selectividad a partir de células individuales. La técnica es relevante cuando se necesita la medición directa de proteínas en células individuales, con aplicaciones que abarcan desde las biociencias fundamentales hasta la biomedicina aplicada.


¿Cómo se cuantifican las transferencias Western?

Usé ImageJ para obtener el área gris media usando un área fija para cada proteína de interés, resté el fondo y luego lo reporté como una proporción de mi control de carga.

Mi pregunta es: ¿cómo lo haría USTED? Al observar las bandas, hay una diferencia de más del doble entre las muestras tratadas y no tratadas, pero eso no se refleja en los datos. Muestra la tendencia, pero no creo que muestre a los lectores nada que no puedan ver con solo mirar a las bandas.

Revisé el protocolo que publicaste. No entiendo por qué lo haces de esa manera. ImageJ tiene una herramienta de cuantificación de bandas de gel incorporada.

Vaya a Analizar - & gt Gels - & gt Seleccione el primer carril (luego use ctrl + 2 para seleccionar todos los otros carriles y ctrl + 3 para trazar los datos). Esto automáticamente hace lo que dice la parte del protocolo que publicó, es decir, obliga a la caja que está utilizando para seleccionar los datos a mantener un tamaño fijo.

Cuando aparecen los gráficos de señal, puede definir la línea de base y medir el área debajo de la curva (que esencialmente es restar el fondo). Esto también le dará algunos comentarios si su mancha está sobreexpuesta (lo cual, mirándolo, probablemente lo sea), ya que obtendrá un & # x27flat top & # x27 en su curva de intensidad en lugar de un pico agudo.

¡Oye, gracias por tu rápida respuesta!

Hice lo que dijiste (re: analyse- & gtgels) pero luego obtengo 10 de la misma trama que se ve así: https://imgur.com/detePpq

¿Cómo hago lo que describe en su tercer párrafo?

He hecho el área debajo de la curva para cada banda en la Imagen J, quizás eso sea lo mismo que hiciste tú. Además, podría ser que, dado que su mancha está sobreexpuesta, comience a estabilizar su banda más abundante y pierda la capacidad de cuantificar con precisión.

¿Tiene una guía / protocolo para ese proceso? Me encantaría probarlo

Lo primero que noté: a menos que esté leyendo esto incorrectamente, NO hay forma de que D3 sea solo un cambio de 2 veces (o tal vez esté más cerca de 3 veces, pero es difícil saber cómo has presentado los datos). La diferencia entre esas bandas parece mucho más grande que D7. Dos cosas:

1 - Las bandas más intensas se ven saturadas, debe intentar una exposición más corta para la cuantificación. Esta es una de las razones por las que pasé de la quimioluminiscencia a la fluorescencia, especialmente para la cuantificación.

2 - Me pregunto si hizo algo diferente en el análisis. Esta es la guía que usé en el pasado para ImageJ y transferencias quimioluminiscentes

Normalizar al GAPDH es bueno.

Siempre que quiero cuantificar la proteína que es al menos algo abundante, utilizo transferencias de Western fluorescentes con el sistema LICOR Odyssey. No puedo recomendarlo lo suficiente si tiene acceso, y si lo tiene, me complacerá contárselo todo.

En cuanto a si este análisis es necesario o no, yo diría que lo es. Es posible que no tenga que mostrarlo en la figura final, solo téngalo para usted o para los revisores. Desea poder decir que el tratamiento condujo a un cambio de 2 o 3 veces en la fluorescencia cuando lo escribe, en lugar de simplemente dar una declaración cualitativa. La cuantificación es siempre el camino a seguir, por lo que está en el camino correcto.

Te interesará saber por qué solo usas la odisea cuando las proteínas están en abundancia. me acabo de enterar por ahí & # x27s 2 en el campus que podría haber estado usando todo el tiempo (suspiro)

Como señalaron otros, debería calcular el área bajo la curva, no el valor medio de gris en su rectángulo. Tomar el valor medio podría funcionar si las bandas fueran aproximadamente del mismo tamaño, pero en su muestra no lo son, por lo que no le proporcionará datos confiables. El área debajo de la curva es básicamente el total de todos los píxeles de su banda y sería un mejor método de cuantificación. Por ejemplo, lo hice brevemente con la imagen que proporcionó (tenga en cuenta que imgur comprime la imagen) y obtuvo una diferencia de 2.8 veces en las muestras D3.

Prefacio: Es mejor encontrar su rango lineal antes incluso de intentar la cuantificación. Esto puede ser tan simple como cargar una serie de diluciones en serie de su lisado y luego identificar un rango de exposición para la detección de película o IR que le brinde intensidades mensurables no saturadas para las diluciones que normalmente carga. Por tanto, un buen ejemplo de un mini gel sería lisado de 25 µg, 12,5 µg, 6,25, 3,125, etc. Luego, establece / optimiza las concentraciones de anticuerpos, los tiempos de lavado / tampones y el tiempo de desarrollo.

Como mínimo, asegúrese de no haber & # x27t saturado su señal (un valor de píxel máximo / mínimo para sus LUT en imageJ, por ejemplo). Ni siquiera vale la pena cuantificar las bandas saturadas.

Aquí se explica cómo lo hago cuando necesito cuantificar bandas para réplicas biológicas que se ejecutan en diferentes membranas. Comienza con el proceso de PAGE / transferencia. ¡No descuide la coherencia allí!

Cargue masas de muestra iguales y transfiéralas con corriente constante, utilizando los mismos mW * h / cm 2 de membrana para depositar cantidades similares de proteína en sus membranas. Esto normaliza la corriente para el área de la membrana y el tiempo de transferencia. Mejora enormemente la consistencia.

Desarrolle sus manchas con tiempos similares de acuerdo con su curva de dilución o experiencia empírica, como se indicó anteriormente. Escanee las películas a un DPI lo suficientemente alto para evitar bandas pixeladas o capture una exposición de alta resolución para los métodos de imágenes de infrarrojos. Guardar como .tif.

En ImageJ, use una imagen en escala de grises de 8 o 16 bits y emplee Selección & gt Especifique para recortar áreas de membrana completas del mismo tamaño de cada membrana / película / foto IR (asegúrese de incluir todos los carriles / marcadores / anotaciones - don & # x27t solo recorte su banda de interés). Guarda esto como una imagen separada. Hago esto porque facilita el envío de imágenes de transferencia completa a revistas y reduce el tamaño de los archivos.

Utilice Process & gtSubtract Background para reducir las intensidades del fondo.

Utilice Transform & gtRotate para alinear sus bandas horizontalmente. Esto es importante para hacer que su área debajo de las medidas de la curva a continuación, ya que mantendrá sus picos bien alineados en el paso & quot; trazar carriles & quot.

Nuevamente use Selección & gtSpecify para dibujar un rectángulo vertical ligeramente más ancho que el tamaño de su banda, y con una longitud lo suficientemente larga como para capturar todo el carril (en caso de que haya bandas más pequeñas o más grandes).

Use Tools & gtGels para seleccionar el primer carril (Ctrl 1), y luego Ctrl 2 para cada carril subsiguiente. Por último, & quot; traza carriles & quot con Ctrl 3.

Sus picos deben estar separados de la línea de base, o casi debido a la resta de fondo. Ahora dibuje un rectángulo verticalmente a través de la ventana de carriles trazados de manera que los bordes izquierdo y derecho del rectángulo abarquen los límites izquierdo y derecho de cada pico, y la parte superior / inferior del rectángulo encierre todos los picos. Presione Ctrl D para dibujar el rectángulo. Este paso incluye un pico normalizado de línea de base en la misma posición para cada carril (si los picos no se alinean bien, es posible que deba volver al paso 5 para rotar sus bandas, o puede que necesite aproximar la base de cada pico individualmente.

Utilice la herramienta de varita para medir áreas bajo la curva (AUC).

Exporte sus AUC a MATLAB o Excel, o cualquier programa en el que desee procesar números.

Normalice cada área al área de una banda de control de muestra. Por ejemplo, los carriles "sin tratar" o "tipo salvaje" pueden servir como estándar de normalización. Este valor se convertirá en & quot1 & quot y cada otra banda será una fracción o un múltiplo de ella. Repita esto para sus bandas de control de carga, o bandas de proteína total si busca modificaciones postraduccionales.

Normalice los valores normalizados de control de muestra a su control de carga o controles de proteína total, respectivamente.

Esto es similar si todas las réplicas biológicas están en una membrana. Solo tendrá alguna variación en sus valores de control de muestra normalizados. El promedio de este valor se convierte en su valor de normalización, por lo que nuevamente habrá una tendencia central / promedio de 1 para los controles no tratados o de tipo salvaje (o cualquiera que sea su línea de control).

Finalmente, algunas cosas que insisto en nuestro laboratorio:

Los resultados de la transferencia Western tendrán una variabilidad inherente que reduce la sensibilidad y oculta algunas diferencias obvias si no ejecuta el experimento con suficientes réplicas biológicas para dar cuenta de la variación. Así que planifique los tamaños de las muestras de antemano teniendo en cuenta el tamaño del efecto en un experimento preliminar y acepte los resultados tal como son. No continúe "agregando más réplicas" para reducir la variación aparente y obtener resultados "significativos". Ese & # x27s llamado p-hackeo. No es ético y es mala conducta en la investigación.


Resultados

El acetato restaura la acetilación de histonas bajo hipoxia

Las células cancerosas demandan nutrientes extracelulares distintivos y reprograman las vías metabólicas para sobrevivir y proliferar cuando se enfrentan a situaciones difíciles, como la hipoxia 25. El estrés por hipoxia es un actor fundamental en la tumorigénesis y el desarrollo de tumores 26. Al realizar un análisis de exometaboloma basado en espectros de 1 H-NMR, encontramos que las células cancerosas absorbieron alrededor del 20% de acetato del medio de cultivo bajo normoxia, mientras que más del 80% de acetato se consumió bajo hipoxia (Fig. 1a Fig. 1a, b complementaria), sugiriendo que las células cancerosas absorben más acetato bajo hipoxia que nomoxia 7,9,14. Además, llevamos a cabo la cuantificación de acetato de cinco pares de carcinoma hepatocelular (HCC) y muestras adyacentes por RMN. Como se muestra en la Fig. 1c complementaria, el rango de concentración de acetato fue de 0,56 a 2,67 μmol g -1 en tejido húmedo (izquierda) y la concentración de acetato en tejido se estimaría aproximadamente entre 0,56 y 2,67 mM (derecha). En la mayoría de los casos, las concentraciones de acetato oscilaron alrededor de 0,5 mM y en dos muestras de HCC, los niveles de acetato alcanzaron 2,5 mM (Fig. 1c complementaria). Para explorar el efecto del acetato sobre las células cancerosas, tratamos células HepG2 con acetato en hipoxia y encontramos que el acetato contrarrestaba la acetilación de histonas disminuida en hipoxia en comparación con normoxia (Fig. 1b). De particular interés, el acetato indujo un aumento significativo de los niveles de acetilación de H3K9, H3K27 y H3K56, pero no los niveles de acetilación de H3K14, H3K18, H3K23 y H3K36 (Fig. 1b). Esto indica que el acetato rescata la acetilación de histonas reducida por hipoxia con cierta especificidad. Más importante aún, mediante el uso de la técnica de etiquetado metabólico basada en cromatografía líquida y espectrometría de masas en tándem en modo de monitoreo de reacción múltiple (LC-MRM MS), identificamos 13 C2- péptidos acetilados H3K9 (Fig. 1d suplementaria), H3K27 (Fig. 1e suplementaria) y H3K56 (Fig. 1f suplementaria) en células HepG2 tratadas con [U-13 C2] -acetato, lo que demuestra que la acetil-CoA derivada de acetato se incorporó de hecho a las histonas. Además, en comparación con la normoxia, la acetilación de histonas es más susceptible a la suplementación con acetato bajo hipoxia, incluso a baja concentración, en células HepG2, A549 y DU 145 (figura 1c, figura complementaria 1g, h).

(a) Espectros de 1 H-RMN de concentración de acetato en medio fresco, medio de células cancerosas cultivadas bajo normoxia o hipoxia. Los resultados representaron la media ± desviación estándar. de experimentos triplicados. (** PAG& lt0.01 *PAG& lt0.05 por estudiante de dos colas no emparejado t-prueba). (B) El acetato rescata los niveles de acetilación de H3K9, H3K27 y H3K56 reducidos por hipoxia. Las células HepG2 se trataron con o sin acetato 2,5 mM en hipoxia (1% de O2) durante 4 h. Los niveles de acetilación de histonas se determinaron mediante transferencia Western. Total H3 sirvió como control de carga. (C) Las células cancerosas son más sensibles al acetato bajo hipoxia. Las células HepG2 se trataron con las concentraciones indicadas de acetato en condiciones de normoxia o hipoxia (1% de O2) durante 4 h. Los niveles de acetilación de histonas se determinaron mediante transferencia Western. Total H3 sirvió como control de carga. (D) El acetato aumenta los niveles de acetilación de H3K9, H3K27 y H3K56 de una manera dependiente del tiempo bajo hipoxia. Las células HepG2 se trataron con o sin acetato 5 mM durante 0,5, 1, 2 y 4 h en hipoxia (1% de O2), respectivamente. Los niveles globales de acetilación de histonas se determinaron mediante Western blot. La histona H3 total sirvió como control de carga. (mi) El acetato aumenta los niveles de acetilación de H3K9, H3K27 y H3K56 de una manera dependiente de la dosis bajo hipoxia. Las células HepG2 se trataron con las concentraciones indicadas de acetato durante 4 h en hipoxia (1% O2). Los niveles de acetilación de histonas se determinaron mediante transferencia Western. Total H3 sirvió como control de carga.

Para caracterizar la forma de regulación epigenética por acetato, tratamos células cancerosas con acetato para diferentes puntos de tiempo bajo hipoxia. Encontramos que el suplemento de acetato exógeno aumentó rápidamente los niveles de acetilación de H3K9, H3K27 y H3K56 de una manera dependiente del tiempo bajo hipoxia en diferentes líneas de células cancerosas (Fig. 1d, Fig. Complementaria 1i, j). El suplemento de acetato aumentó drásticamente los niveles de acetilación de H3K9, H3K27 y H3K56 en 2 h (Fig. 1d Fig. Complementaria 1i, j). Además, se encontró que el acetato aumenta los niveles de acetilación de las histonas H3K9, H3K27 y H3K56 de una manera dependiente de la dosis bajo hipoxia en HepG2 (Fig.1e), A549 (Fig.1k complementaria), DU145 (Fig.1l complementaria), SkBr3 (Fig. Fig. 1m) y celdas HT29 (Fig. Complementaria 1n). La concentración baja de acetato (1,25 mM) aumentó ligeramente los niveles de acetilación de histonas, mientras que las concentraciones más altas de acetato (2,5-5 mM) aumentaron significativamente los niveles de acetilación de histonas bajo hipoxia (Fig. 1e Fig. Complementaria 1k, l, m, n). En conjunto, estos datos implican que el acetato está implicado en la regulación de la acetilación de histonas bajo hipoxia.

El acetato activa epigenéticamente la lipogénesis de novo

Es bien sabido que la acetilación de histonas está asociada con la actividad de transcripción 27,28,29. Para investigar el efecto biológico sobre el metabolismo del cáncer inducido por la acetilación de histonas mediada por acetato, detectamos los cambios de expresión de ARNm de genes metabólicos. Diseñamos cebadores de PCR cuantitativa (qPCR) dirigidos a 139 genes metabólicos, que cubren una amplia gama de vías metabólicas (es decir, glucólisis, ciclo de TCA, vía de pentosa fosfato, metabolismo del glucógeno, metabolismo de cuerpos cetónicos, metabolismo de aminoácidos, síntesis de ácidos grasos y β-oxidación). , síntesis de colesterol, metabolismo de esfingolípidos y transportadores relacionados con el metabolismo) (Tabla complementaria 1) y se realizó qPCR para detectar posibles vías metabólicas afectadas por la regulación epigenética inducida por acetato. El diagrama de dispersión de los datos de expresión de ARNm de 139 genes en células HepG2 se mostró en la Fig. 2a, comparando el cultivo celular en hipoxia con normoxia. La expresión de VEGF y LDHA, que se incluyeron como controles positivos para verificar el efecto hipóxico, aumentaron en más del doble bajo hipoxia (Fig. 2a). Luego probamos el efecto del acetato sobre la expresión génica bajo normoxia (Fig. 2b) o hipoxia (Fig. 2c), respectivamente.En comparación con el grupo de normoxia, los genes regulados positivamente por dos veces en el grupo de hipoxia y la hipoxia con el grupo de acetato mostraron mucho solapamiento (Fig. 2a complementaria). Además, FASN y ACSS2 fueron los genes únicos en la hipoxia con el grupo acetato, lo que indica que el acetato jugó un papel importante en la síntesis de lípidos bajo hipoxia (Fig. complementaria 2a). En linea con esto, FASN y ACACA Los niveles de ARNm se activaron más del doble con acetato en hipoxia, mientras que no se observó ningún efecto de activación en normoxia (Fig. 2b, c). Ambos FASN y ACACA están en la lista de los 10 principales genes metabólicos regulados al alza inducidos por acetato en hipoxia, lo que indica que el acetato afecta predominantemente de novo síntesis de lípidos en comparación con otras vías metabólicas (Fig. 2c, d). Curiosamente, ACSS1 y ACSS2 Los niveles de ARNm disminuyeron bajo hipoxia en comparación con la normoxia (Fig.2a), lo que fue discrepante con los otros estudios que informaron que ACSS2 fue regulada al alza bajo hipoxia 9,14. Esto puede deberse a las condiciones experimentales, como las diferentes líneas celulares utilizadas y los puntos temporales del tratamiento. Además, el nivel de ARNm de ACSS1 y ACSS2, en vez de ACLY, también se regularon positivamente con el tratamiento con acetato bajo hipoxia (Fig. 2c, d). El rescate de hipoxia reducida ACSS1 y ACSS2 La expresión por acetato puede indicar que ACSS1 y ACSS2 juegan un papel importante en la adaptación de las células cancerosas a la hipoxia.

(a) Gráfico de dispersión de los datos de expresión de ARNm de 139 genes metabólicos en células HepG2, comparando células tratadas con hipoxia (y eje) a normoxia (X eje). El valor de expresión de ARNm de experimentos por triplicado se mostró en una escala log 2. Las líneas grises indicaron diferencias dobles en los niveles de expresión de ARNm entre dos grupos. Genes regulados al alza (& gt2 veces cambio, PAG& lt0.05) se mostraban en magenta. Genes expresados ​​regulados a la baja (& gt2 veces cambio, PAG& lt0.05) se mostraban en azul. Estudiante de dos colas no emparejado t-se utilizó la prueba. (B) Gráfico de dispersión de los datos de expresión de ARNm de 139 genes metabólicos en células HepG2 bajo normoxia, comparando células tratadas con acetato 2,5 mM (y eje) a libre de acetato (X eje). El valor de expresión de ARNm de experimentos por triplicado se mostró en una escala log2. Las líneas grises indicaron diferencias dobles en los niveles de expresión de ARNm entre dos grupos. Genes regulados negativamente (& gt2 veces cambio, PAG& lt0.05) se mostraban en azul. Estudiante de dos colas no emparejado t-se utilizó la prueba. (C) Gráfico de dispersión de los datos de expresión de ARNm de 139 genes metabólicos en células HepG2 bajo hipoxia, comparando células tratadas con acetato 2,5 mM (y eje) sin acetato (X eje). El valor de expresión de ARNm de experimentos por triplicado se mostró en una escala log 2. Las líneas grises indicaron diferencias dobles en los niveles de expresión de ARNm entre dos grupos. Genes regulados al alza (& gt2 veces cambio, PAG& lt 0,05) se mostraban en magenta. Estudiante de dos colas no emparejado t-se utilizó la prueba. (D) Análisis de cambio de pliegues de la expresión de ARNm de 139 genes en células HepG2 tratadas con o sin acetato 2,5 mM bajo hipoxia. (mi,F) FASN (mi) y ACACA (F) Los niveles de ARNm en células HepG2 tratadas con las concentraciones indicadas de acetato durante 12 h bajo normoxia o hipoxia se cuantificaron mediante qPCR. Los resultados se presentaron como media ± desviación estándar. de experimentos triplicados. (gramo,h) Ensayos de ChIP-qPCR que muestran enriquecimiento de acetilación de H3K9, H3K27 y H3K56 en FASN (gramo) y ACACA (h) regiones promotoras en células HepG2 tratadas con las concentraciones indicadas de acetato en normoxia o hipoxia durante 4 h. Se incluyó IgG de conejo como control negativo. Cada histograma se presentó como media ± desviación estándar. de experimentos triplicados (*PAG& lt0.05 ** PAG& lt0.01 NS, no significativo para estudiantes de dos colas no emparejados t-prueba).

Además, investigamos si la acetilación de histonas inducida por acetato se asoció con la transcripción de genes promovida por acetato en la lipogénesis. Tratamos células cancerosas con concentraciones en gradiente de acetato y descubrimos que FASN y ACACA La expresión de ARNm se incrementó de una manera dependiente de la dosis bajo hipoxia (Fig. 2e, f). Curiosamente, el cambio en FASN y ACACA La expresión de ARNm es más propensa a concentraciones bajas de acetato bajo hipoxia, en comparación con el control normóxico (Fig. 2e, f). Para caracterizar si la regulación positiva de los genes lipogénicos es causada por la acetilación de histonas inducida por la suplementación con acetato, tratamos las células cancerosas con tricostatina A (TSA), un inhibidor de histona desacetilasa, como control positivo. Encontramos que el TSA y el acetato aumentaron tanto el nivel de acetilación global de la histona H3 como la expresión de ARNm de FASN y ACACA, aunque TSA y acetato no tuvieron efecto sinérgico (Fig. 2b complementaria). Además, el tratamiento con acetato condujo a una mejora dependiente del tiempo de los niveles de acetilación de H3K9, H3K27 y H3K56 (Fig. 2c complementaria). En consonancia con el aumento de acetilación de histona H3, FASN y ACACA Las expresiones de ARNm también se elevaron de manera dependiente del tiempo (Fig. 2c complementaria). Además, llevamos a cabo ensayos de ChIP-qPCR para definir el mecanismo subyacente de la FASN y ACACA Expresiones Encontramos que el acetato mejoró notablemente el nivel de acetilación de H3K56 en los promotores de FASN y ACACA (Fig.2d, e) complementaria, pero no ACLY (Figura complementaria 2f). Además, encontramos que la acetilación de histonas (H3K9ac, H3K27ac y H3K56ac) en los promotores de FASN y ACACA respondieron al tratamiento con acetato de una manera dependiente de la dosis y la acetilación de histonas fue más propensa a ser inducida por una concentración baja (≤2,5 mM) de acetato en hipoxia, en comparación con la normoxia (Fig. 2g, h). Estos resultados demuestran que el acetato es capaz de regular epigenéticamente genes lipogénicos a concentraciones patofisiológicas.

Para descartar la posibilidad de que la acetilación del promotor de FASN y ACACA refleja un aumento de la transcripción, alternativamente realizamos ChIP-qPCR y probamos la acetilación de histonas promotoras de LDHA y VEGF (Fig. Complementaria 2g, h, i, j). Los niveles de acetilación (H3K9ac, H3K27ac y H3K56ac) en LDHA y VEGF los promotores aumentaron bajo hipoxia, que se incrementó aún más mediante la suplementación con acetato (Fig. complementaria 2g, h, i, j). Consistentemente, la expresión de ARNm de LDHA y VEGF también fue activado por acetato (Fig. complementaria 2k, l). Estas observaciones sugieren que el acetato contribuye a la acetilación de histonas en los promotores de genes inducidos por hipoxia. En conjunto, estos datos apoyan nuestra noción de que el acetato promueve la vía de síntesis de lípidos a través de la regulación epigenética.

La lipogénesis inducida por acetato no refleja la demanda de lípidos

Las células cancerosas muestran una mayor demanda de lípidos, a través de la eliminación de lípidos extracelulares o de novo síntesis de lípidos 2,30,31. Intentamos averiguar si la expresión inducida por acetato de FASN o ACACA se ve afectado por los lípidos extracelulares bajo hipoxia. De acuerdo con los datos de la figura 2, FASN y ACACA La expresión de ARNm era más propensa a ser inducida por acetato en hipoxia, en comparación con la normoxia (Fig.3a, c) y la acetilación de histonas del promotor activado por acetato de FASN y ACACA más pronunciadamente bajo hipoxia (Fig. 3b, d). Además, la depleción de lípidos en el suero no alteró la expresión inducida por acetato de FASN y ACACA en células HepG2 (Fig. 3e, Fig. 3a complementaria). Similar, FASN y ACACA La acetilación de la histona promotora tampoco se vio afectada por la depleción de lípidos (Fig. 3f, Fig. 3b complementaria). Además, la suplementación con palmitato no cambió la expresión de FASN, VEGF y ACACA (Fig. 3g Fig. Complementaria 3c, d). Consistentemente, la acetilación de histonas en las regiones promotoras de FASN y ACACA no respondió a la suplementación con palmitato (Fig. 3h. Fig. complementaria 3e). Estos resultados demuestran que el acetato aumenta la acetilación de histonas en los promotores de genes lipogénicos y activa su expresión de ARNm, sin reflejar la demanda de lípidos de las células hipóxicas.

(a) FASN La expresión en células HepG2 tratadas con las concentraciones indicadas de acetato durante 12 h en normoxia o hipoxia se cuantificó mediante qPCR. Los resultados se presentaron como media ± desviación estándar. de experimentos triplicados (** PAG& lt0.01 NS, no significativo para el estudiante t-prueba). (B) Ensayos de ChIP-qPCR que muestran enriquecimiento de acetilación de histonas en FASN región promotora en células HepG2 tratadas con concentraciones indicadas de acetato en normoxia o hipoxia durante 4 h. Se incluyó IgG de conejo como control negativo. Cada histograma se presentó como media ± desviación estándar. de experimentos triplicados (** PAG& lt0.01 NS, no significativo para el estudiante t-prueba). (C) ACACA expresión en células HepG2 tratadas como en el panel (a) fueron cuantificados por qPCR. Los resultados se presentaron como media ± desviación estándar. de experimentos triplicados (** PAG& lt0.01 NS, no significativo para el estudiante t-prueba). (D) Ensayos de ChIP-qPCR que muestran enriquecimiento de acetilación de histonas en ACACA región promotora en células HepG2 tratadas como en B. Cada histograma se presentó como media ± desviación estándar. de experimentos triplicados (** PAG& lt0.01 NS, no significativo para el estudiante t-prueba). (mi) Cuantificación de FASN expresión en células HepG2 tratadas con o sin acetato 2,5 mM en medio más FBS al 10% o LPDS al 10% durante 12 h en hipoxia mediante qPCR. Los resultados se presentaron como media ± desviación estándar. de experimentos triplicados (** PAG& lt0.01 de Student's t-prueba). (F) Ensayos de ChIP-qPCR que muestran niveles de acetilación de histonas en FASN región promotora en células HepG2 tratadas como en mi durante 4 h bajo hipoxia. Los resultados se presentaron como media ± desviación estándar. de experimentos triplicados (** PAG& lt0.01 de Student's t-prueba). (gramo) Cuantificación de FASN expresión en células HepG2 tratadas con LPDS al 10% más la concentración indicada de palmitato (PA) durante 12 h bajo normoxia o hipoxia por qPCR. Los resultados se presentaron como media ± desviación estándar. de experimentos por triplicado (NS, no significativo por el estudiante t-prueba). (h) Ensayos de ChIP-qPCR que muestran el enriquecimiento de los niveles de acetilación de histonas en FASN región promotora en células HepG2 tratadas como en gramo durante 4 h bajo normoxia o hipoxia. Los resultados se presentaron como media ± desviación estándar. de experimentos por triplicado (NS, no significativo por el estudiante t-prueba).

ACSS1 y ACSS2 están involucrados en la lipogénesis inducida por acetato

En los mamíferos, dos enzimas principales participan en la producción de acetil-CoA a partir del acetato: el ACSS2 citosólico y su parálogo mitocondrial ACSS1. Para analizar qué enzima es responsable de mediar el aumento de acetilación de histonas inducido por acetato, derribamos ACSS1 o ACSS2 individualmente y evaluaron los niveles de acetilación de histonas correspondientes. Para nuestra sorpresa, el derribo de cualquiera ACSS1 o ACSS2 fue incapaz de bloquear el aumento inducido por acetato en los niveles de acetilación en los sitios H3K9, H3K27 y H3K56 (Fig. complementaria 4a, b). Aunque discrepa con los otros estudios que informaron que ACSS2, pero no ACSS1, parecía ser la enzima clave involucrada en la metabolización del acetato para la síntesis de lípidos 5,9, nuestros hallazgos fueron consistentes con los de Yun et al. 32 y Bjornson et al. 33, que informó que ACSS1 también era vital para la síntesis de lípidos dependiente de acetato. Estos resultados indican que ACSS1 y ACSS2 son funcionalmente redundantes. Luego establecimos ACSS1/2 grupos de células estables de doble derribo. Derribo concurrente de ACSS1/2 El uso de dos conjuntos diferentes de ARNhc inhibió dramáticamente el aumento inducido por acetato en los niveles de acetilación de H3K9, H3K27 y H3K56 bajo hipoxia (Fig. 4a, Fig. 4c complementaria). Además, realizamos una cuantificación basada en LC-MRM MS para ver si ACSS1/2 el doble derribo podría reducir la abundancia de péptidos de acetilación de histonas derivados del acetato mediante el uso de [U-13 C2] -trazador de acetato. Se encontró que la acetil-CoA derivada de acetato se incorporó activamente en los sitios de acetilación de H3K9, H3K14 y H3K27, en comparación con los sitios de acetilación de H3K18, H3K23 y H3K56 (Fig. 4b, Fig. 4d complementaria). Estos resultados demuestran que el acetato podría funcionar como un donante de acetilo para inducir la acetilación de histonas. ACSS1/2 doble caída indujo una disminución más significativa de 13 C2-Péptidos acetilados H3K9, H3K27 derivados de [U-13 C2] -acetato (Fig. 4b Suplementaria Fig. 4d). En cuanto a la discrepancia de la acetilación de H3K56 entre los datos de transferencia Western y la cuantificación de MS, podría deberse al hecho de que la concentración de 13 C2El péptido H3K56 acetilado marcado era demasiado bajo para alcanzar el límite de cuantificación. Además, diseñamos experimentos para probar si ACSS1/2 doble caída podría bloquear la acetilación de histonas inducida por acetato en FASN y ACACA regiones promotoras. ACSS1 / 2 La eficacia de la eliminación se verificó mediante qPCR (Fig. 4e complementaria). Encontramos que los niveles de acetilación de H3K9, H3K27 y H3K56 aumentados con acetato en FASN (Fig. 4c) y ACACA (Fig. 4d) las regiones promotoras fueron bloqueadas por ACSS1/2 doble caída bajo hipoxia. ACSS1/2 La caída no tuvo ningún efecto sobre los niveles de acetilación de histonas en ACLY región promotora (Fig. 4e). Consecuentemente, ACSS1 / 2 derribo bloqueado inducido por acetato FASN expresión (Fig. 4f complementaria). En conjunto, nuestros datos demuestran que el acetato contribuye a la acetilación de histonas de una manera dependiente de ACSS1 / 2 bajo hipoxia.

(a) Destrucción simultánea estable de ACSS1 y ACSS2 bloquea totalmente el aumento inducido por el acetato de los niveles de acetilación de histonas. Niveles de acetilación de histonas en shscr o shACSS1 / 2 Las células HepG2 tratadas con o sin acetato 2,5 mM bajo normoxia o hipoxia se analizaron mediante transferencia Western. (B) 13 C2-los niveles de H3K9ac y H3K27ac marcados se reducen en ACSS1 / 2 derribar. Cuantificación de 13 C2niveles de acetilación de histona H3 marcados en shscr o shACSS1 / 2 Línea celular estable HepG2 tratada con [U-13 C2] -acetato durante 4 h en hipoxia se analizó mediante LC-MRM MS. El porcentaje indica la relación de H3K [13 C2-ac] / H3Kac total en cada sitio. Los resultados se presentaron como media ± desviación estándar. de experimentos triplicados (*PAG& lt0.05 *** PAG& lt0.001 de Student's t-prueba). (C,D) ACSS1 / 2 knockdown bloquea totalmente la asociación de acetilación de histonas inducida por acetato con FASN y ACACA promotor. Se realizaron ensayos de ChIP-qPCR para determinar el enriquecimiento de acetilación de H3K9, H3K27 y H3K56 en FASN (C) y ACACA (D) región promotora en shscr o shACSS1 / 2 Líneas celulares estables de HepG2 tratadas con o sin acetato en hipoxia durante 4 h. Se incluyó IgG como control negativo. Los resultados se presentaron como media ± desviación estándar. de experimentos triplicados (** PAG& lt0.01 *** PAG& lt0.001 NS, no significativo para el estudiante t-prueba). (mi) Se realizaron ensayos de ChIP-qPCR para determinar el enriquecimiento de acetilación de H3K9, H3K27 y H3K56 en ACLY región promotora en shscr o shACSS1 / 2 Células HepG2 tratadas como en C. Se incluyó IgG como control negativo. Los resultados se presentaron como media ± desviación estándar. de experimentos por triplicado (NS, no significativo por el estudiante t-prueba).

Un estudio anterior relacionó el metabolismo de la glucosa dependiente de ACLY con la acetilación de histonas 1,22. Para diseccionar las contribuciones de diferentes fuentes de carbono a la acetilación de histonas, realizamos ensayos de qPCR y ChIP-qPCR en ACSS1 / 2-Knockdown y / o ACLY-Células de derribo. Se verificó la eficacia de derribo (Fig. 4g complementaria). Agotamiento de cualquiera ACSS1 / 2 o ACLY reducción de la expresión génica de LDHA y VEGF, que se redujeron aún más por la caída de ambos ACSS1 / 2 y ACLY (Fig. Complementaria 4h, i). Consistentemente, ya sea ACSS1 / 2 o ACLY Knockdown redujo la acetilación de histonas en las regiones promotoras de LDHA y VEGF (Fig. Complementaria 4j, k, l, m). Estos resultados demuestran que tanto ACSS1 / 2 como ACLY contribuyen a la acetilación de histonas bajo hipoxia.

La lipogénesis inducida por acetato promueve la supervivencia celular

Para probar si el acetato afectaría la reserva de lípidos en las células cancerosas, cultivamos células estables HepG2 en un medio con [U-13 C marcado con isótopos2] -acetato durante 24 h en hipoxia y midió los isotopólogos del conjunto de ácidos grasos mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS). ACSS1 / 2 de hecho, la doble caída disminuyó la contribución fraccional del acetato a la síntesis de palmitato y estearato (Fig. 5a). Estos resultados son consistentes con el modelo que estimula el acetil-CoA derivado del acetato de novo síntesis de lípidos 5,7,9. Además, derribamos FASN expresión al estado no estimulado mediante el uso del ARNip de baja eficiencia como en la Fig. 5a complementaria, y las células tratadas con [U-13 C marcado con isótopos2] -acetato en hipoxia. los de novo La síntesis de lípidos a partir del carbono derivado del acetato se redujo en FASN derribar las células, lo que demuestra que el acetato funciona como un donante de acetilo para promover la lipogénesis y el acetato inducido FASN La expresión juega un papel importante en la lipogénesis (Fig. 5b). Dado que la síntesis de lípidos elevada podría promover la supervivencia de las células tumorales en hipoxia 2,25, llevamos a cabo el ensayo CCK8 y encontramos que el suplemento de acetato mejoraba la supervivencia celular en hipoxia, pero no en normoxia (Fig. 5c). Para cuestionar si el acetato promueve la supervivencia de las células cancerosas mediante la regulación de genes lipogénicos, empleamos ARNip específicos dirigidos FASN o ACACA, de los cuales las eficiencias de derribo relativamente bajas son capaces de suprimir el acetato simulado FASN y ACACA Expresión de ARNm a un nivel similar al estado no estimulado (Fig. 5a complementaria). Descubrimos que la supervivencia celular inducida por acetato en hipoxia se inhibía por la eliminación de cualquiera FASN o ACACA, lo que indica que la supervivencia celular promovida por acetato dependía de la lipogénesis y la inducción de la expresión del gen lipogénico era vital para la supervivencia celular (Fig. 5d). Sorprendentemente, encontramos que la inhibición de cualquiera FASN o ACACA al nivel sin tratar no tuvo ningún efecto sobre el acetato inducido FASN acetilación de la histona del promotor (Fig. 5b complementaria). Intentamos analizar más a fondo si el acetato inducido de novo La síntesis de lípidos es vital para las células cancerosas cultivadas bajo hipoxia. Encontramos que las células HepG2 y SkBr3 eran más sensibles a C75, un inhibidor químico de FASN, cuando se cultivaban bajo hipoxia (Fig.5c complementaria), de acuerdo con el informe anterior de que las células cancerosas dependían de de novo síntesis de lípidos bajo hipoxia 9. Además, el tratamiento con C75 anuló la supervivencia de las células cancerosas inducidas por acetato sin afectar FASN y ACACA Niveles de ARNm (Fig. complementaria 5d, e, f). Consecuentemente, ACSS1 / 2 La caída bloqueó el aumento de la supervivencia celular inducida por el suplemento de acetato, lo que indica que la supervivencia celular inducida por acetato fue ACSS1 / 2-dependiente (Fig. 5e). Además, realizamos el ensayo Matrigel y descubrimos que las células HepG2 a las que se les suministró acetato mostraron una ventaja de crecimiento sobre el grupo de control, y este efecto fue bloqueado por ACSS1 / 2 doble derribo (Fig. 5f). En conjunto, más allá de funcionar como un precursor de la lipogénesis, el acetato también sirve como donante de acetilo para inducir la acetilación de histonas y la expresión de ARNm de genes lipogénicos, contribuyendo a la adaptación de las células cancerosas a la hipoxia.

(a) ACSS1 / 2 media la producción de palmitato y estearato inducida por acetato. Abundancia fraccionada de isotopólogos de palmitato (izquierda) y estearato (derecha) en ACSS1 / 2 células HepG2 de caída doble estable (designadas como magenta) en comparación con las de las células de control (designadas como negras) después de 24 h de cultivo bajo hipoxia con [U-13 C2]-acetato. Cada histograma se presentó como media ± desviación estándar. de experimentos triplicados. El recuadro muestra el porcentaje de acetil-CoA lipogénico derivado del acetato de carbono (** PAG& lt0.01 de Student's t-prueba). (B) Abundancia fraccional de isotopólogos de palmitato (panel izquierdo) y estearato (panel central) en scramble (siscr) y siFASN Las células HepG2 se tratan como en a. Cada histograma se presentó como media ± desviación estándar. de experimentos triplicados. El recuadro muestra el porcentaje de acetil-CoA lipogénico derivado del acetato de carbono. La eficiencia de eliminación se detectó mediante PCR con transcripción inversa (panel derecho) (** PAG& lt0.01 NS, no significativo para el estudiante t-prueba). (C) El acetato promueve la supervivencia celular bajo hipoxia. La viabilidad de las células HepG2 tratadas con las concentraciones indicadas de acetato en normoxia o hipoxia se determinó mediante el ensayo CCK8. Los resultados se presentaron como media ± desviación estándar. de experimentos triplicados (** PAG& lt0.01 *** PAG& lt0.001 NS, no significativo para el estudiante t-prueba). (D) Viabilidad de control o siFSAN o siACACA Las células HepG2 tratadas con o sin acetato 2,5 mM en hipoxia se determinaron mediante el ensayo CCK8. Los resultados se presentaron como media ± desviación estándar. de experimentos triplicados (*** PAG& lt0.001 de Student's t-prueba). (mi) ACSS1 / 2 media la promoción de la supervivencia celular por el acetato. Viabilidad de shscr o shACSS1 / 2 Las líneas celulares estables de HepG2 tratadas como se indica se determinaron mediante el ensayo CCK8. Los resultados se presentaron como media ± desviación estándar. de experimentos triplicados (*PAG& lt0.05 NS, no significativo para el estudiante t-prueba). (F) ACSS1 / 2 media la ventaja del crecimiento celular por el acetato en Matrigel. Shscr o shACSS1 / 2 Se sembraron células HepG2 en el lecho de Matrigel y se cultivaron con DMEM con FBS al 10% y Matrigel al 2% durante 12 días antes de que se tomaran las imágenes (izquierda). Barra de escala, 0,25 mm. Los datos cuantitativos se presentaron como media ± desviación estándar. (norte& gt3) (derecha) (*** PAG& lt0.001 NS, no significativo para el estudiante t-prueba).

ACSS1 / 2 se correlaciona positivamente con la expresión de FASN en HCC

Se informa que ACSS2 está regulado positivamente en varios cánceres humanos 3,5,9. También se informa que ACSS1 aumenta en el carcinoma hepatocelular 33. A través de un análisis de 190 datos de muestras de HCC humano del Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) 34, encontramos una correlación significativa entre FASN y ACSS2 Niveles de ARNm y sin correlación significativa entre FASN y ACSS1 Niveles de ARNm (Fig. 6a complementaria). Nuestros resultados antes mencionados demostraron que el acetato podría regular epigenéticamente FASN expresión, lo que nos impulsa a examinar los niveles de acetilación de ACSS1 / 2, FASN y H3 y su correlación en el HCC humano. Recolectamos 53 pares de muestras primarias de HCC humano con tejidos normales adyacentes y determinamos cambios en las proteínas (ACSS1, ACSS2 y FASN) y seis marcas de acetilación de histonas (H3K9ac, H3K14ac, H3K18ac, H3K23ac, H3K27ac y H3K56ac) en todas estas muestras (norte= 53) (Fig. 6a Fig. Complementaria 6b). Para realizar un análisis estadístico de la asociación entre ACSS1 / 2 y la acetilación de histonas, dividimos las muestras de tumores en dos grupos según la firma de ACSS1 / 2 (alta versus baja). Los tumores con una expresión 1,5 veces mayor de ACSS1 o ACSS2 o ambos que la del tejido de control normal adyacente se agrupan en tumores de alta expresión de ACSS (tumor / normal ≥1,5, norte= 26), mientras que los tumores de SCA de baja expresión (tumor / normal & lt1.5, norte= 27) expresan ambas proteínas ACSS 1,5 veces por debajo de su control normal (Fig. 6b). Encontramos 16 casos con ACSS1 de alta expresión, 8 casos con ACSS2 de alta expresión y 2 casos con ACSS1 y ACSS2 de alta expresión (fig. 6b). El mayor porcentaje de casos de alta expresión de ACSS1 que el de ACSS2 demuestra plenamente la importancia de ACSS1 en la utilización de acetato por el cáncer. Nuestros resultados demuestran que cuatro de las seis marcas de acetilación de histonas, incluida la H3K9ac (PAG= 0,0220), H3K14ac (PAG= 0,0289), H3K27ac (PAG= 0,0034) y H3K56ac (PAG= 0,0410), son significativamente más fuertes en los tumores de alta expresión de ACSS que en los tumores de baja expresión de ACSS con Student de dos colas no apareado t-prueba (Fig. 6c). De acuerdo con esta observación, el nivel de proteína FASN también se regula significativamente al alza en tumores de alta expresión de ACSS (Fig. 6d). De manera consistente, realizamos análisis de inmunohistoquímica (IHC) y encontramos que la expresión de ACSS1 / 2 se correlacionó positivamente con la acetilación de H3 y la expresión de FASN en HCC humano. En la figura 6e se muestra un caso representativo. Utilizando el análisis de correlación de Spearman, hemos evaluado la relación entre la acetilación de histonas y la expresión de FASN. Sorprendentemente, todas y cada una de las marcas de acetilación de histonas en nuestro análisis exhiben una correlación positiva significativa con la expresión de FASN (PAG& lt0.0001 para H3K9ac, PAG= 0,0003 para H3K14ac, PAG= 0,0009 para H3K18ac, PAG= 0.0385 para H3K23ac, PAG& lt0.0001 para H3K27ac y PAG& lt0.0001 para H3K56ac Fig.6c complementario). En conjunto, estos resultados apoyan fuertemente una correlación positiva entre ACSS1 / 2, FASN y acetilación de histonas en HCC humano.

(a) Niveles de proteína FASN, ACSS1 y ACSS2 (paneles superiores, normalizados frente a β-actina) y niveles de acetilación de H3K9, H3K14, H3K18, H3K23, H3K27 y H3K56 (paneles inferiores, normalizados frente a la histona H3) en 53 pares de HCC (cada uno emparejado con El tejido canceroso (designado como C) y el tejido normal adyacente (designado como N)) se analizaron mediante transferencia Western. Se mostraron dos pares de muestras representativas. Para los otros 51 pares de muestras, consulte la Fig. 6b complementaria. (B) Mapa de calor de expresión de proteínas (ACSS1, ACSS2 y FASN) y niveles de acetilación de histonas (H3K9ac, H3K14ac, H3K18ac, H3K23ac, H3K27ac y H3K56ac) en los 53 pares de HCC. Los datos se presentaron como Z-puntaje de expresión proteica relativa o acetilación de histonas. Los tumores con una expresión 1,5 veces mayor de ACSS1 o ACSS2 o ambos que la del tejido de control normal adyacente se agrupan en tumores con SCA alto (tumor / normal ≥1,5, norte= 26), mientras que los tumores con SCA bajo (tumor / normal & lt1.5, norte= 27) expresan ambas proteínas ACSS a 1,5 veces menos que su control normal. (C) H3K9ac (PAG= 0,0220), H3K14ac (PAG= 0,0289), H3K27ac (PAG= 0,0034) y H3K56ac (PAG= 0,0410), son significativamente más fuertes en los tumores con SCA alto que en los tumores con SCA bajo. Los análisis estadísticos se realizaron con un Student's no apareado de dos colas. t-prueba (*PAG& lt0.05 ** PAG& lt0.01 NS, no significativo). (D) El nivel de proteína FASN se regula significativamente al alza en tumores con alto SCA (PAG= 0,002). Los análisis estadísticos se realizaron con un Student's desemparejado de dos colas. t-prueba ( ** PAG& lt0.01). (mi) Resultados de tinción inmunohistoquímica representativos para ACSS1, ACSS2, FASN y acetilación de H3K9 / K27 / K56 en tejido normal adyacente (N) y carcinoma hepatocelular (C). Barra de escala, 100 μm.


Resultados

Un ensayo que combina DAntiguo Testamento-Bmucho y ImmunoDetection (DBID) detecta in vitro interacciones ADN-proteína

Para desarrollar un método para descubrir un inhibidor químico de la unión al ADN y probarlo en CGGBP1, necesitábamos cumplir con las siguientes condiciones previas: (i) detectar la unión al ADN independiente de la secuencia y su inhibición, (ii) la unión al ADN debe incluir la unión a repeticiones, y (iii) ningún requisito de conocimiento previo sobre la estructura de la proteína diana (en este caso, no se informa la estructura de CGGBP1). Además, buscamos desarrollar un método que fuera aplicable a cualquier combinación de ADN y proteína y que se basara en principios simples de bioquímica que puedan personalizarse de forma económica según la elección de los experimentadores. Diseñamos un ensayo simple para detectar inhibidores de las interacciones proteína-ADN tomando prestados los principios de la transferencia Southwestern [50, 51] y la inmunoquímica [52, 53] y lo aplicamos para CGGBP1.

Se extrajo ADN genómico de cultivos de HEK293T de rápido crecimiento y se sonicó para generar

Fragmentos de 1 kb (longitud media) de largo. Se empaparon discos cargados positivamente de membranas de nailon en solución de ADN genómico sonicado y el ADN se unió covalentemente a los discos de membrana de nailon mediante horneado al vacío a 80ºC durante 90 min sin desnaturalización (Fig. 1a). Se inmovilizó un estimado de 0,5 µg de ADN en cada disco de membrana. Los discos de membrana unidos a ADN se bloquearon usando suero bovino fetal en solución salina tamponada con fosfato complementado con triton X-100 y posteriormente se usaron como sondas para capturar proteínas de lisados ​​celulares. La incubación de discos de membrana recubiertos de ADN con lisados ​​celulares concentrados permite capturar los complejos de proteínas de unión al ADN presentes en los lisados ​​(Fig. 1b). Estos discos de membrana reticulados y recubiertos de ADN se denominan en lo sucesivo "dot blots".

Una representación esquemática del DAntiguo Testamento-Bmucho y ImmunoDensayo de detección (DBID). a: Se aisló ADN genómico de células HEK293T. Los fragmentos de ADN sonicados (longitud media de 1 kb) se transfirieron a membranas de nailon cargadas positivamente y se reticularon mediante calentamiento al vacío a 80ºC. B: Se lisaron células HEK293T y los lisados ​​aclarados se utilizaron como fuente de proteína para la unión al ADN in vitro. El ensayo que se muestra aquí está diseñado para detectar la unión de CGGBP1 (círculo negro) al ADN, aunque este protocolo se puede aplicar genéricamente para cualquier proteína de interés. CGGBP1 puede unirse al ADN directamente (panel superior) o indirectamente (a través de proteínas enlazadoras, representadas en el círculo azul en el panel inferior). La detección posterior basada en inmunoquímica informa de una señal marrón para los complejos de ADN-CGGBP1 directos e indirectos por igual. La inmunoquímica emplea un anticuerpo primario contra la proteína de interés, un anticuerpo secundario biotinilado, conjugados de estreptavidina-HRP y DAB como sustrato cromogénico y es de naturaleza semicuantitativa. C: La preincubación del lisado celular con inhibidores permite que los compuestos de moléculas pequeñas se unan a sus proteínas diana afines en el lisado. Solo algunos de estos compuestos inhiben potencialmente la unión al ADN de sus proteínas diana (ejemplificado con una cruz amarilla). D: Se describen los diferentes resultados posibles del ensayo DBID para la inhibición de las interacciones CGGBP1-ADN. Se espera que la inhibición directa de CGGBP1 (círculo negro con una cruz) así como la inhibición de una proteína enlazadora (círculo azul con una cruz) requerida para la unión de CGGBP1-ADN resulten en “Sin señal”. Los inhibidores que no tienen ningún efecto directo o indirecto sobre la interacción CGGBP1-ADN muestran "Señal"

Los lisados ​​se prepararon a partir de células HEK293T como se describe en los métodos. Las proteínas en los lisados ​​se preincubaron con los compuestos en la biblioteca a una concentración uniforme de 100 µM (o 0 µM como control negativo para la inhibición) (Fig. 1c). Posteriormente, las mezclas de lisado-inhibidor se incubaron con las transferencias puntuales en un tampón de unión durante 90 min a 4 ° C. Las transferencias de puntos se lavaron en PBS y se reticularon usando formaldehído al 4%. Los complejos de ADN-proteína fijados en las transferencias puntuales se sondaron con un anticuerpo anti-CGGBP1 primario seguido de detección inmunohistoquímica (Fig. 1d). Para la detección a escala de biblioteca, las transferencias de puntos se incubaron en serie con anticuerpo secundario biotinilado, conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (HRP) y sustrato de HRP cromogénico que incluía peróxido de hidrógeno. Las señales se evaluaron visualmente para seleccionar inhibidores potentes. Para el cribado adicional de un panel de resultados primarios del cribado de la biblioteca, se utilizaron anticuerpos secundarios conjugados con HRP directamente seguidos de la detección quimioluminiscente. Las señales en las transferencias de puntos secundarios se cuantificaron usando densitometría de imágenes invertidas de las transferencias.

Primero, nos aseguramos de que la detección fuera específica mediante el uso de controles negativos. La señal cromogénica detectada en las transferencias puntuales usando el anticuerpo anti-CGGBP1 fue específica ya que la señal se redujo a un fondo débil cuando el anticuerpo primario se reemplazó con IgG o suero de control de isotipo. De manera similar, reemplazar el lisado con el tampón de bloqueo disminuyó la señal.

Pantalla de biblioteca para la identificación de inhibidores CGGBP1 usando DBID

Para identificar los inhibidores de la interacción CGGBP1-ADN, preincubamos los lisados ​​de células HEK293T con inhibidores de una biblioteca de compuestos bioactivos antes de permitir la captura de complejos de proteínas mediante dot blots unidos al ADN. La preincubación con cualquier compuesto que inhibiera con éxito las interacciones ADN-CGGBP1 daría como resultado una señal más débil usando un anticuerpo anti-CGGBP1 en comparación con una inhibición simulada (solo el tampón de dilución del compuesto) (Fig. 2a). El lisado se incubó con cada compuesto por separado a una concentración final de 100 µM. La naturaleza paralela de la incubación de compuesto-proteína en este protocolo hizo que fuera conveniente usar una sola concentración para todos los compuestos en la biblioteca. Como la inhibición de la unión al ADN requiere concentraciones de fármaco más altas [22], nos decidimos por una concentración de 100 µM para toda la biblioteca de cribado. Dado que esta concentración era solo para el cribado in vitro, en el que los aciertos se someterían a experimentos de verificación, elegimos esta concentración. Por lo tanto, la elección de una concentración química de 100 μM probablemente eliminaría los falsos negativos, mientras que los experimentos de verificación posteriores para los resultados de la pantalla a concentraciones más bajas nos permitirían eliminar los falsos positivos. La mayoría de los compuestos de la biblioteca no mostraron inhibición de la unión de CGGBP1-ADN, mientras que un subconjunto de compuestos mostró una inhibición de moderada a fuerte de la unión de CGGBP1-ADN (Fig. 2b yc). Las 1685 dot blots, una para cada compuesto de la biblioteca, se clasificaron en tres grupos: sin inhibición para 1554 compuestos (señales fuertes y consistentes comparables a la inhibición simulada), inhibición moderada para 20 compuestos (señal relativamente más débil en comparación con la inhibición simulada), y una fuerte inhibición para 11 compuestos (señales insignificantes a muy débiles en comparación con la inhibición simulada) (Fig. 2b). Para 100 compuestos, el ensayo no fue concluyente y los eliminamos del análisis.

El cribado DBID de una biblioteca química de moléculas pequeñas (1685 compuestos) identifica inhibidores de la interacción CGGBP1-ADN. a: El ensayo DBID primario se realizó en múltiples placas de 96 pocillos. El lisado se preincubó individualmente con los compuestos (un compuesto por pocillo). Después de transferir los complejos lisado-compuesto (como se muestra en la Fig. 1c) a dot blots (como se muestra en la Fig. 1a), se realizó la detección inmunoquímica usando un cóctel de anticuerpo primario anti-CGGBP1 de conejo. El esquema representa las señales obtenidas para una placa de 96 pocillos. B: Las transferencias de puntos de todo el cribado de la biblioteca para CGGBP1 se clasificaron manualmente en 11 inhibidores fuertes y 20 inhibidores moderados. Las imágenes reales de estos dos grupos de manchas de puntos se muestran aquí junto con los controles positivo y negativo como se indica. Las identidades de los inhibidores son las siguientes: Inhibidores potentes [A1-Givinostat (ITF2357), A2-LRRK2-IN-1, A3-Peficitinib (ASP015K, JNJ-54781532), B1-Ispinesib (SB-715992), B2-TWS119 , B3-Domperidona, C1-Trietioduro de gallamina, C2-Moxifloxacina HCl, C3-Sirtinol D1-NAD +, D2-Palbociclib (PD-0332991) HCl], Inhibidores moderados [A5-VX-661, A6-BRD73954, A7-NCT- 501, A8-Tenovin-1, A9-Prasugrel, B5-U0126-EtOH, B6-Foretinib (GSK1363089), B7-JNJ-7706621, B8-CHIR-99021 (CT99021), B9-Maleato de asenapina, C5-Etilparabeno, C6 -LY2874455, C7-Golgicida A, C8-PD173955, C9-Mirin, D5-Ramelteon, D6-Cilnidipina, D7-Dopamina HCl, D8-VR23, D9-AZD3759]. La mayoría de los compuestos de la biblioteca no mostraron ninguna inhibición de la interacción CGGBP1-ADN. Treinta manchas de puntos representativas de los no inhibidores se muestran en los pocillos números F1-F10, G1-G10, H1-H10. C: Las señales para las transferencias de puntos que se muestran en B se cuantifican mediante densitometría. El gráfico muestra las señales de las imágenes invertidas para cada mancha de puntos

Aunque pudimos identificar algunos inhibidores de la interacción CGGBP1-ADN, no quedó claro si la inhibición fue directa o indirecta. Seguimos buscando los inhibidores identificados en esta pantalla primaria para detectar inhibidores directos de las interacciones CGGBP1-ADN.

Aplicación de DBID para identificar inhibidores directos de CGGBP1

Para identificar los inhibidores directos de la unión CGGBP1-ADN, el siguiente conjunto de experimentos se realizó en CGGBP1 recombinante (rCGGBP1) que contenía una etiqueta FLAG C-terminal y un panel de inhibidores disponibles identificados en la selección primaria. Las transferencias de puntos se bloquearon con tampón de bloqueo. De manera similar, en lugar de los lisados, se incubó rCGGBP1 durante 30 min con los inhibidores (100 µM) identificados en el cribado primario. La mezcla de inhibidor de rCGGBP1 se incubó con los dot blots bloqueados y se sondaron con anticuerpos anti-FLAG o anti-CGGBP1 seguidos de incubación de anticuerpos secundarios conjugados con HRP y detección de señales quimioluminiscentes (Fig.3a yb) (datos sin procesar en archivos adicionales 1, 2, 3, 4, 5 y 6). Las señales se cuantificaron y analizaron mediante densitometría (Fig. 3c). Los inhibidores utilizados en este ensayo DBID secundario podrían clasificarse nuevamente como que tienen (i) inhibición directa baja o nula detectable (Palbociclib, BRD73954, Peficitinb, LRRK2-IN-1 e Ispinesib) o (ii) inhibición moderada (Sirtinol y Tenovin-I ). Solo un compuesto, Givinostat, mostró una fuerte inhibición de la interacción rCGGBP1-ADN (Fig. 3c).

Givinostat actúa como un inhibidor directo específico de la interacción rCGGBP1-ADN in vitro. A y B: DBID con anti-FLAG (a) o anticuerpos anti-CGGBP1 (B) contra rCGGBP1 preincubado con compuestos como se indica muestran una inhibición directa por Givinostat. Las múltiples manchas de puntos por compuesto son réplicas técnicas. C: Cuantificación de las señales obtenidas de los dot blots del cribado secundario (B) se trazan. D: Las señales densitométricas del ensayo DBID para CGGBP1 utilizando concentraciones más bajas de Givinostat no muestran inhibición a concentraciones inferiores a 100 μM. mi: La preincubación de rCGGBP1 con Givinostat reduce la cantidad de ADN de Alu que coprecipita con el anticuerpo FLAG en un 70-80%. F: Una cuantificación relativa de δδCt normalizada por entrada de ADN de ChIP CGGBP1 de células HEK293T tratadas con Givinostat o DMSO 2 μM durante las duraciones indicadas muestra la inhibición de la ocupación de CGGBP1 en elementos Alu por Givinostat. gramo: El ensayo DBID para proteínas nucleares extraídas con ácido utilizando anticuerpo de histona H3 total no muestra inhibición de la unión al ADN de la histona H3 por Givinostat. h: Las señales DBID (sustraídas de fondo y normalizadas para señales de IgG) para H3K4me3, H3K9me3 y la histona total H3 no muestran cambios significativos debido a Givinostat 100 μM. I y j: qPCR en CTCF y H3K4me3 ChIP-DNA muestran que H3K4me3 aumenta significativamente en elementos Alu (I) mientras que la ocupación de CTCF en un sitio de unión de CTCF regulado por CGGBP1 se reduce significativamente (j) por tratamiento con Givinostat. * indica Mann-Whitney pag-valor & lt 0.05 ns representa pag-valor & gt 0.05. k: El análisis de la fracción citoplásmica nuclear de células HEK293T tratadas con simulacro o con Givinostat mostró que los niveles nucleares de CGGBP1 e histona H3 permanecen sin cambios con el tratamiento con Givinostat. GAPDH sirve como control de carga para la fracción citoplásmica. l: Una comparación del ADN genómico tratado con Givinostat o DNasaI muestra que Givinostat no causa la degradación del ADN mientras que la DNasaI digiere el ADN en fragmentos de bajo peso molecular y aumenta el frotis de bajo peso molecular

Para establecer el efecto de concentraciones más bajas de Givnostat sobre la interacción CGGBP1-ADN, el ensayo se volvió a realizar en una serie de concentraciones de Givnostat (10 μM, 1 μM, 0.1 μM, 0.01 μM y 0.001 μM). Las concentraciones inferiores a 100 μM no produjeron inhibición detectable en DBID (Fig. 3d) (datos sin procesar en el archivo adicional 7). Sin embargo, esto podría deberse en parte a un rango dinámico bajo en las señales DBID.

Verificación de la inhibición de la interacción CGGBP1-ADN por Givinostat

A continuación, verificamos la inhibición de la interacción rCGGBP1-ADN utilizando un enfoque alternativo. El ADN de Alu es un sitio de unión fuerte para CGGBP1 y las interacciones entre el ADN de Alu y CGGBP1 se han demostrado antes tanto in vitro como in vivo [32].

Realizamos inmunoprecipitación in vitro de ADN de Alu utilizando rCGGBP1 con o sin inhibición por Givinostat. La diferencia en la cantidad de ADN de Alu inmunoprecipitado usando rCGGBP1 inhibido de forma simulada o CGGBP1 inhibido por Givinostat se cuantificó usando PCR en tiempo real (Fig. 3e). Usando la cantidad de ADN de Alu de entrada como control, pudimos establecer que Givinostat es un inhibidor directo fuerte de la interacción CGGBP1-Alu ADN.

Además, la inhibición de la interacción CGGBP1-ADN por Givinostat fue validada por el ChIP-qPCR para los sitios de unión de CGGBP1. Se realizó un chip para CGGBP1 en células HEK293T tratadas con Givinostat 2 μM para diferentes puntos de tiempo (6 hy 24 h). Givinostat provocó la inhibición de la unión de CGGBP1-ADN como es evidente a partir de la amplificación de ChIP-qPCR para Alu a las 6 h en comparación con 0 h (inhibición simulada, DMSO). Esta inhibición aumentó significativamente tras el tratamiento de las células con Givinostat durante 24 h (Fig. 3f).

Para probar rigurosamente los límites del ensayo DBID, necesitábamos probar el protocolo sobre la unión al ADN de una proteína presuntamente no inhibida por Givinostat. Elegimos aplicar DBID en la histona H3 y sus formas modificadas postraduccionalmente H3K9me3 y H3K4me3. Aunque las histonas H3 y CGGBP1 son proteínas no relacionadas, ambas tienen pesos moleculares comparables y se unen al motivo de ADN de forma independiente. Además, H3K9me3 y H3K4me3 están regulados de forma diferente por el agotamiento de CGGBP1 en las células HEK293T [41]. Por lo tanto, comparamos los resultados con los ensayos de ChIP-qPCR sobre H3K4me3 y CTCF, una proteína diana conocida de CGGBP1 [41].

El ensayo DBID usando un anticuerpo de histona H3 total contra proteínas extraídas con ácido de núcleos purificados mostró que Givinostat no inhibió la unión al ADN de la histona H3 (Fig. 3g) (datos sin procesar en los archivos adicionales 8 y 9). Un análisis similar con H3K4me3 y H3K9me3 y su comparación con la histona H3 total mostró que Givinostat no inhibió la unión al ADN de estas formas de histona H3 (Fig. 3h) (datos sin procesar en el archivo adicional 10). Aunque algunas réplicas técnicas en el ensayo DBID H3K4me3 mostraron una amplia variación de la señal DBID, ninguna de ellas fue significativa (prueba de Mann-Whitney pag & gt 0,05). Se empleó ChIP para CTCF o H3K4me3 seguido de qPCR para probar si en las células HEK293T una inhibición de CGGBP1 por Givinostat podría imitar los efectos ya conocidos del agotamiento de CGGBP1 por shRNA. El tratamiento con givinostat no afectó la ocupación de CTCF pero aumentó significativamente los niveles de H3K4me3 en los elementos Alu (Fig. 3i). Por el contrario, en un sitio de unión de CTCF dependiente de CGGBP1 recién determinado en el que H3K4me3 no se ve afectado por el agotamiento de CGGBP1, pudimos establecer que el tratamiento con Givinostat redujo la ocupación de CTCF sin ningún cambio significativo en los niveles de H3K4me3 (Fig. 3j).

Los análisis de transferencia de Western de fracciones nucleares y citoplásmicas de células HEK293T tratadas con simulacro o con Givinostat mostraron que los niveles de CGGBP1 en la fracción nuclear no se redujeron debido al tratamiento con Givinostat (Fig. 3k) (datos sin procesar en los archivos adicionales 11 y 12) . De manera similar, los niveles de histona total H3 o H3K4me3 en la fracción nuclear no se vieron afectados por el tratamiento con Givinostat (Fig. 3k). Por lo tanto, la reducción en la ocupación de CGGBP1 en los elementos Alu, la ocupación de CTCF en los sitios de unión de CTCF regulados por CGGBP1 y un aumento en H3K4me3 en los elementos Alu no se debió a cambios en las distribuciones subcelulares de estas proteínas. Además, también nos aseguramos de que la inhibición inducida por Givinostat de la unión al ADN observada en los ensayos DBID y los IP de ADN in vitro no se debieran a la degradación del ADN. El ADN genómico de alto peso molecular de las células HEK293T se incubó con Givinostat (para imitar las condiciones de incubación de DBID) o DNasaI (control positivo para la digestión del ADN). Si bien la DNaseI digirió el ADN y generó un frotis de bajo peso molecular, no se observó degradación del ADN mediante la incubación con Givinostat (Fig. 3l) (datos sin procesar en el archivo adicional 13).


DISCUSIÓN

La pista de que el agotamiento de la frataxina podría estar relacionado con la síntesis de vitamina D provino de datos [49] que revelan que, en un modelo celular humano de células de la granulosa, el agotamiento de la frataxina dio como resultado una síntesis deficiente de esteroides (progesterona). En este proceso mitocondrial, la adrenodoxina (ferredoxina) transfiere electrones de una reductasa al citocromo CYP11A1 correspondiente, para la conversión de colesterol en pregnenolona. Curiosamente, la ferredoxina también es el vínculo entre la ferredoxina reductasa (FDXR) y CYP27B1 para el paso final de la síntesis de calcitriol, una reacción que tiene lugar en las mitocondrias [50]. Además, ya se describió que la ferredoxina interactúa físicamente con la frataxina [36]. En este contexto, la posibilidad de que el agotamiento de la frataxina pueda afectar las enzimas de la vía biosintética del calcitriol y los efectos posteriores, nos lleva a analizar los efectos de la suplementación de este compuesto en las células deficientes en frataxina.

Los resultados que se muestran aquí revelan que los niveles de FDX1 están significativamente por debajo de los que se encuentran en las neuronas DRG normales o en las células linfoblastoides FA (Figs. 1 y S1), lo que respalda la justificación de que la suplementación con calcitriol debería poder recuperar la supervivencia celular después del agotamiento de la frataxina. Aunque somos conscientes de que la explicación de cómo la deficiencia de frataxina da como resultado una disminución de los niveles de FDX1 aún no tiene respuesta, se ha observado deficiencia de proteínas que contienen grupos de Fe / S en varios modelos de la enfermedad [51,52]. Sin embargo, son posibles otras explicaciones: sería concebible que esta proteína pudiera ser el objetivo de las proteasas mitocondriales activadas por calcio, como resultado del desequilibrio de calcio que se produce después de la deficiencia de frataxina que aquí se informa (Fig. 3). Además, se debe tener en cuenta que se sabe que la deficiencia de frataxina causa estrés oxidativo [53] y que las proteínas del racimo Fe / S son propensas al daño oxidativo y la degradación [54,55]. Por esta razón, no podemos descartar la posibilidad de que la recuperación de los niveles de FDX1 inducida por calcitriol pueda ser promovida por un aumento de las defensas antioxidantes, ya que es bien sabido que el calcitriol desencadena tal respuesta. De hecho, ambos efectos pueden actuar sinérgicamente sobre la recuperación de cantidades de FDX1.

Se ha informado del papel beneficioso del calcitriol en las enfermedades neurodegenerativas en la enfermedad de Alzheimer al reducir los niveles de proteína beta amiloide [56,57] o disminuir los eventos neurotóxicos en modelos animales de enfermedad de Parkinson [58]. Además, la vitamina D contribuye a la neuroprotección [59] y previene el deterioro cognitivo en el cerebro envejecido [60]. Es importante mencionar que el VDR, el receptor intracelular de calcitriol, ha sido detectado en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos, destacando la importancia que tanto el VDR como el calcitriol pueden jugar en el desarrollo cerebral [61,62]. Además, la presencia de CYP27B1 en varios tipos de células del cerebro, incluidas las células endoteliales, la microglía, las neuronas y los astrocitos [63], sugiere que la síntesis de calcitriol podría ser una en el lugar proceso en el sistema nervioso central.

Los resultados también revelan que el calcitriol es capaz de revertir los marcadores celulares alterados que describimos en artículos anteriores, como los niveles de NCLX. Restaurar los niveles de NCLX mediante el tratamiento con calcitriol es un resultado relevante (Fig. 3A y B) porque esta proteína es clave para mantener el equilibrio correcto de sodio / calcio en las mitocondrias [41,64] de varios tipos de células como neuronas, linfocitos, páncreas células beta, cardiomiocitos [43]. En las neuronas nociceptivas, el NCLX tiene un papel fundamental debido a su coordinación con los canales TRPV1 [65] la inhibición del intercambiador y el desequilibrio del calcio se ha descrito en una forma familiar de la enfermedad de Parkinson [66] además, el NCLX se ha relacionado con la hipertrofia cardíaca [ 45] e implicado en la secreción de insulina [67-69]. La razón por la que este intercambiador muestra niveles reducidos en células deficientes en frataxina no se comprende bien, pero podría estar relacionada con las proteasas activadas por calcio ya que, como se informó en un artículo anterior [34], BAPTA pudo restaurar parcialmente NCLX a niveles normales. En este contexto, hemos demostrado recientemente que los inhibidores de la calpaína, como MDL28170 y calpeptina, dan como resultado la restauración parcial de los niveles de NCLX en las neuronas DRG deficientes en frataxina y la reducción de los niveles de calpaína 1 da como resultado una neuroprotección [47]. Además, como se publicó recientemente [13], las alteraciones en el potencial de la membrana mitocondrial pueden tener un impacto negativo en la función de NCLX. Dado que hemos observado que los GRD se muestran alterados Ψmetro, podría afectar la actividad de las cantidades restantes de NCLX, agravando así la homeostasis del calcio mitocondrial.

La razón principal por la que el calcitriol podría ejercer estos efectos beneficiosos sobre las células deficientes en frataxina es el aumento observado en los niveles de frataxina en varios tipos de células. Los resultados mostrados en neuronas DRG (figura 2) han sido corroborados por los aumentos observados en líneas celulares linfoblastoides derivadas de pacientes con AF (figura S2). Para complementar aún más estos resultados, hemos proporcionado datos adicionales que muestran que la frataxina es inducida significativamente por calcitriol en cardiomiocitos deficientes en frataxina (Figura S3). En este modelo celular, el calcitriol también ejerce efectos beneficiosos sobre los marcadores alterados, como la acumulación de gotitas de lípidos y el agrandamiento de las mitocondrias (Fig. S4). Estos efectos restauradores en los miocitos cardíacos son atribuibles a la recuperación de las cantidades de frataxina y la mejora de las funciones mitocondriales, pero también podría considerarse un efecto directo del calcitriol sobre el aumento de la vía de oxidación beta, como sugieren los hallazgos descritos en los adipocitos 3T3-L1 [70]. Además, no podemos descartar la posibilidad de que el calcitriol contribuya a prevenir la acumulación de gotitas de lípidos [71].

Aunque el mecanismo a través del cual la suplementación con calcitriol da como resultado un aumento en las cantidades de frataxina en los modelos celulares probados necesita más investigación, una posibilidad razonable sería que el calcitriol podría aumentar la transcripción del gen de la frataxina. En apoyo de esta noción, vale la pena mencionar que los análisis in silico del promotor del gen de la frataxina en la base de datos EPDnew (https://epd.epfl.ch//index.php), revelan la presencia de motivos de unión a VDR predichos dentro de la región promotora del gen de la frataxina. De hecho, a partir de estos datos, la región promotora humana del gen de la frataxina contiene cinco regiones en las posiciones −812, −543, −497, −321, −282 del sitio de inicio de la transcripción (TSS) con un punto de corte (p- valor) de 0,001. Este valor es de la misma magnitud que los encontrados para genes que son dianas de VDR muy conocidas: genes relacionados con la homeostasis del calcio como la parvalbúmina, el intercambiador de calcio NCX1 (SLC8A2-2) o relacionados con genes de defensa antioxidante como la glutatión peroxidasa, o NRF2 (NFE2L2-4), por citar algunos [24,28]. Es interesante recordar que NRF2, a su vez, activa la transcripción de genes antioxidantes y desintoxicantes como la catalasa, las superóxido dismutasas o la tiorredoxina reductasa [72]. En este contexto, los efectos beneficiosos del calcitriol, como inductor natural de NRF2, están de acuerdo con una de las terapias emergentes para la AF que se basa en la activación de NRF2 incluyendo sulforafano [73], dimetilfumarato [74] o omaveloxolona [75, 76].

Aunque todavía no podemos proporcionar una explicación de por qué el agotamiento de la frataxina da como resultado una disminución de los niveles de FDX1, el efecto del calcitriol sobre la restauración de sus cantidades podría ser (i) una consecuencia de la recuperación de los niveles de frataxina, (ii) la activación de las defensas antioxidantes que, como resultado, serían proteger a FDX1 del daño oxidativo y la degradación, (iii) aumentar la expresión de FDX1 inducida directamente por calcitriol como se informó [77] o una combinación de los tres. De hecho, en neuronas DRG normales, hemos encontrado inducción (1,5 a 2 veces) de FDX1 por calcitriol (datos no mostrados) que sería indicativo de un efecto genómico en relación con la expresión del gen FDX1. Se necesitarán experimentos futuros para aclarar este punto. Sin embargo, a partir de los resultados proporcionados en este trabajo, se puede concluir que el calcitriol podría considerarse para pacientes con AF porque el marco terapéutico y los efectos secundarios son muy conocidos, lo que permite una fácil prueba de dosificación.


CD36 es una proteína transmembrana presente en muchos tejidos que se cree que facilita el transporte de ácidos grasos hacia el interior. La transferencia Western es el método más utilizado para medir el contenido de proteína CD36 en los tejidos, pero requiere mucho tiempo, es técnicamente exigente y semicuantitativo. Para medir con mayor precisión el contenido de CD36 en el tejido adiposo, desarrollamos un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) después de establecer que: 1) los anticuerpos anti-CD36 dieron una única banda distinta en las transferencias Western tradicionales, y 2) la gran mayoría del adipocito CD36 reside en la membrana plasmática. Al usar diluciones en serie de cada muestra e incluir una muestra de calibrador y una muestra de control de calidad en cada placa, pudimos lograr una variabilidad entre ensayos e intraensayo de ∼ 10%. Encontramos que el contenido de CD36 en el tejido adiposo subcutáneo omental y abdominal varió en un rango de 2 a 5 veces dependiendo de los medios de expresión de los datos (por unidades de proteína tisular, peso o lípido). El contenido de CD36 esencial en las mujeres disminuyó notablemente (PAG = 0,01) en función del tamaño de las células grasas. En su mayor parte, el contenido de CD36 en tejido no se correlacionó con el ARNm de CD36. Este método ELISA para el contenido de CD36 en los tejidos debería mejorar la investigación sobre el papel de esta proteína en la absorción de ácidos grasos en los tejidos.

Con el apoyo de las subvenciones DK45343, DK40484 y DK50456 del Servicio de Salud Pública de EE. UU., 7-07-DCS-03 de la Asociación Estadounidense de Diabetes y de la Fundación Mayo.

La dirección actual de A. H. Ali & # x27s es la Rama de Endocrinología Clínica, Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (NIDDK), Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD.


Palabras clave

Abreviaturas: Alix, gen X CC ligado a apoptosis, bobina enrollada CD2BP3, proteína de unión a CD2 3 CIN85, proteína de interacción Cbl de EGFR de 85 kDa, receptor del factor de crecimiento epidérmico GST, glutatión-S-transferasa IP, MAb intraperitoneal, anticuerpo monoclonal PBS, solución salina tamponada con fosfato PI3K, fosfatidilinositol 3 quinasa Ruk, regulador de la quinasa universal SB1, proteína de unión SETA 1 SETA, codificación del dominio SH3, expresado en astrocitos tumorigénicos SH3, homología src tres WB, Western mancha.


Fondo

Además de las fuerzas mecánicas fisiológicas durante la deglución, el habla o la masticación, el ligamento periodontal (PDL) y sus células como parte del periodonto, es decir, el aparato de sujeción del diente, está expuesto a fuerzas aplicadas terapéuticamente, que tienen como objetivo el movimiento ortodóncico del diente [1]. El PDL es un tejido conectivo blando especializado con propiedades viscoelásticas, compuesto principalmente por fibroblastos y matriz extracelular (MEC) [2], entre los que las fibras de colágeno tipo I de Sharpey facilitan el anclaje del diente en el hueso alveolar [3].

Las fuerzas mecánicas que interfieren con el periodonto se dirigen primero a la ECM de la PDL, lo que implica a los fibroblastos de la PDL (PDLF), ya que las células están conectadas a la ECM mediante integrinas [4]. Las integrinas como heterodímeros consisten en combinaciones promiscuas de cadenas α / β, p. αvβ1 o αvβ3, lo que facilita las interacciones célula-matriz vía la formación de contactos focales, que se encuentran en sitios de adhesión focal [5]. Las integrinas como moléculas transmembrana interconectan el microambiente extracelular del PDLF con sus proteínas citoplasmáticas y, por lo tanto, son mecano-sensores o mecano-perceptores, fundamentales para la conversión de señales mecánicas en bioquímicas [6]. Esto se logra mediante la transposición de la señal externa a moléculas mecanotransductoras, co-localizadas junto con integrinas en el complejo de adhesión focal [7]. Una de las moléculas clave en la mecanotransducción es la quinasa de adhesión focal FAK / p125 FAK que se activa a través de la fosforilación en 6-8 residuos de tirosina tras la participación de integrinas de contacto focal por ligandos ECM [8]. En estudios anteriores sobre PDLF, nuestros propios hallazgos revelaron que FAK / p125 FAK parece ser sensible a los mecanismos, ya que su actividad se moduló en respuesta a la cepa [9]. Otras moléculas que son actores clave en la transducción de señales y localizadas aguas abajo de FAK son las MAP-quinasas ERK1 y 2, también conocidas como p42 / 44, y la quinasa de estrés p38 [10, 11]. Los resultados publicados recientemente se suman al creciente cuerpo de evidencia de que estas quinasas no solo son piedras angulares en la transducción de señales, es decir, la mediación de señales desde la membrana plasmática al núcleo sobre la formación de un complejo ligando-factor de crecimiento específico, sino que también tienen la misma prominencia con respecto a la mecanización. transducción. Esto se ejemplifica en un estudio sobre miocitos que demostró que ERK se activa rápidamente tras la cepa y que la quinasa de estrés p38 parece ser el socio de interferencia de ERK en el contexto biológico de la modulación y diferenciación del fenotipo de miocitos [12].

Así, igual en contribución, la membrana plasmática-citoplasma de la señal / mecanotransducción conduce a la activación de factores de transcripción que preceden al transporte de la señal al núcleo [13], que son responsables de la transcripción de los genes de señal / mecanosensibilidad. Entre la plétora de factores de transcripción, c-fos se ha identificado como mecano-sensible [14-16].Junto con c-jun, c-fos forma el factor de transcripción AP-1, este último localizado en el promotor de la metaloproteinasa de matriz- (MMP) 13 [17]. Las MMP, como la MMP-13, que tiene una amplia gama de sustratos que incluyen varios colágenos, fibronectina y proteoglicanos, son responsables de la escisión de las moléculas de ECM en condiciones fisiológicas. Por lo tanto, contribuyen no solo a la homeostasis de la ECM, sino también a situaciones terapéuticas o patológicas. En cuanto a la situación terapéutica, el movimiento dentario de ortodoncia inducido por fuerzas mecánicas no sólo va de la mano de la remodelación periodontal, incluida la reabsorción y formación ósea en los sitios de presión y tensión, respectivamente, sino también con la remodelación de la MEC [18]. En el estado estacionario de ECM, la homeostasis se refleja en el equilibrio de la síntesis y degradación de ECM, mientras que la degradación a su vez se equilibra con la expresión y activación de MMP, que son contrarrestadas por sus inhibidores tisulares específicos, denominados TIMP [19].

En el presente estudio, mostramos que una de las respuestas celulares a la tensión mecánica se ejemplifica mediante la modulación de la expresión de la forma activada de MMP-13, que en el nivel mecanicista se rige por la actividad de MAP y quinasas de estrés p42 / 44 y p38, respectivamente.


EXPRESIONES DE GRATITUD

Los autores agradecen a otros miembros del laboratorio de Boletta por sus útiles discusiones y, en particular, al Dr. Roberto Pagliarini por su ayuda con los gráficos y el análisis estadístico. Esta investigación fue financiada por la PKD Foundation US (PKD-218G18A), la Asociación Italiana para la Investigación de la PKD (AIRP). Los autores agradecen a la Dra. S. Bramani por su continuo apoyo.

La ayuda técnica fue proporcionada por: el Centro de Bioimagen de Microscopía Electrónica y de Luz Avanzada (ALEMBIC), establecido por el Instituto Científico San Raffaele y la Universidad Vita-Salute San Raffaele, para análisis de imágenes, en particular C. Panzeri para imágenes TEM y V. Berno para obtener imágenes de fluorescencia, el Proyecto Intramural de la Clínica de Ratones Ospedale San Raffaele para el apoyo técnico, en particular A. Fiocchi para el análisis histológico y M. Raso del Laboratorio de Química Clínica y Hematología Murina para los análisis hematológicos.



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