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6: Transporte y cinética - Biología

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  • 6A: Difusión pasiva y facilitada
    Este capítulo discutirá los procesos de difusión. Primero, se derivarán ecuaciones de difusión para casos que no involucren un receptor de unión. A continuación, derivaremos ecuaciones para la difusión mediada por receptores a través de una difusión facilitada por la membrana. Nos ocuparemos de la situación en la que el soluto debe transportarse por un gradiente de concentración, un proceso llamado transporte activo.
    • A1. Difusión simple
    • A2. Difusión facilitada
    • A3. Receptores en difusión facilitada
    • A4. Poros de la membrana
    • A5. Uniones celulares - TBA
    • A6. Enlaces y referencias
  • 6B: Cinética de reacciones simples y catalizadas por enzimas
    escribir ecuaciones químicas y diferenciales apropiadas para la tasa de desaparición de reactivos o aparición de productos para reacciones de primer orden, pseudo primer orden, segundo orden, reversibles de primer orden dibujar e interpretar gráficos para ecuaciones de tasa integradas (mostrando las concentraciones de reactivo o producto como una función de tiempo) y ecuaciones de velocidad inicial (que muestran la velocidad inicial vo en función del reactivo;
    • B1: Reacciones de un solo paso
    • B2. Reacciones de varios pasos
    • B3. Reacciones catalizadas por enzimas de equilibrio rápido
    • B4. Reacciones catalizadas por enzimas en estado estacionario
    • B5. Análisis de la ecuación general de Michaelis-Menten
    • B6. Reacciones catalizadas por enzimas más complicadas
    • B7. Significado de las constantes cinéticas
    • B8. Determinación experimental de parámetros cinéticos
  • 6C: inhibición de enzimas
    Dado que la estructura media la función, cualquier cosa que cambie significativamente la estructura de una enzima inhibirá la actividad de la enzima. Por lo tanto, los extremos de pH y alta temperatura, todos los cuales pueden desnaturalizar la enzima, inhibirían la enzima de manera irreversible, a menos que pudiera replegarse correctamente. Alternativamente, podríamos agregar una molécula pequeña que interactúe de manera no covalente con la enzima para cambiar su conformación o prevenir directamente la unión del sustrato.
    • C1: inhibición covalente irreversible
    • C2: inhibición competitiva
    • C3: inhibición no competitiva
    • C4: Inhibición mixta y no competitiva
    • C5. Inhibición de enzimas en vivo
    • C6. Agonista y antagonista de la unión de ligandos a receptores: una extensión
    • C7. Inhibición por cambios de temperatura y pH
    • C8. Enlaces y referencias
  • 6D: Enzimas más complicadas
    En realidad, muchas enzimas tienen más de un sustrato (A, B) y más de un producto (P, Q). Por ejemplo, la enzima alcohol deshidrogenasa cataliza la oxidación del etanol con NAD (un agente oxidante biológico) para formar acetaldehído y NADH.
    • D1. Mecanismos secuenciales de múltiples sustratos
    • D2: Mecanismos de ping-pong de sustratos múltiples
    • D3: inhibidores en reacciones de múltiples sustratos
    • D4. Enzimas alostéricas
    • D5. Integración de unión, difusión y cinética
    • D6. Enlaces y referencias
  • 6E: Problemas con las tareas - Módulos de aprendizaje de literatura: Inhibición de enzimas 1 - KCAT
    • Problemas de tarea - Módulo de aprendizaje de literatura Inhibición de enzimas - KAT: CLAVE

Transporte de moléculas a través de la membrana celular

Los siguientes puntos destacan los cinco procesos involucrados en el transporte de moléculas a través de la membrana celular. Los procesos son: 1. Difusión pasiva 2. Difusión facilitada 3. Transporte activo 4. Translocación grupal 5. Transporte de iones a través de ionóforos.

Proceso n. ° 1. Difusión pasiva:

Por difusión pasiva, las moléculas se mueven a través de la membrana sin interactuar con ninguna proteína transportadora específica en la membrana celular. El movimiento es siempre de una concentración más alta a una más baja y dicho movimiento continúa hasta que la concentración del soluto en ambos lados de la membrana es la misma.

A esa concentración, se alcanza un equilibrio. Sin embargo, si se consume la molécula dentro de la célula, el movimiento hacia adentro continúa, p. el oxígeno transportado a la célula se consume continuamente para la respiración o el dióxido de carbono para la fotosíntesis. Las moléculas que pueden entrar en las células por difusión pasiva son generalmente de tamaño pequeño y de naturaleza no polar.

Proceso # 2. Difusión facilitada:

Este proceso de transporte se diferencia de la difusión pasiva en que requiere una proteína transportadora o portadora. Estas proteínas, también conocidas como permeasas, se encuentran en la membrana y se cree que abarcan todo el ancho de la bicapa lipídica.

Las proteínas transportadoras son específicas para un tipo particular de molécula o, a veces, un grupo de moléculas estrechamente relacionadas. La función de los transportadores es unir la molécula transportable en un lado de la membrana y liberarla en el otro lado. Presumiblemente, esta función está asociada con el cambio conformacional de la molécula de proteína transportadora.

Esto se muestra esquemáticamente en la figura 8.81:

Se han reconocido tres tipos de proteínas transportadoras. Estos son uniportadores que transportan solo un tipo de moléculas en una sola dirección, ya sea de afuera hacia adentro o en la dirección opuesta. Los simportadores pueden transportar dos tipos diferentes de moléculas en la misma dirección y los anti-portadores transportan dos moléculas diferentes en direcciones opuestas.

Las funciones de estos tres tipos de transportadores se muestran esquemáticamente en la figura 8.82:

Las proteínas de transporte se parecen en cierta medida a las enzimas. Tanto los transportadores como las enzimas muestran especificidad o selectividad con respecto al tipo de molécula o grupo de moléculas con las que pueden interactuar. Además, ambos exhiben una cinética de saturación, lo que significa que mediante el aumento gradual de la concentración de las moléculas con las que reaccionan, se alcanza un punto de saturación, más allá del cual un aumento adicional no da como resultado un aumento de la velocidad. Pero hay una diferencia importante. Mientras que las enzimas transforman las moléculas del sustrato en productos, las proteínas transportadoras transportan las moléculas sin cambios a través de la membrana.

La cinética de saturación observada en caso de difusión facilitada está ausente en la difusión pasiva. En la difusión pasiva, el factor decisivo es el gradiente de concentración y la velocidad de transporte aumenta con la diferencia en las concentraciones de las moléculas transportables en los dos lados de la membrana.

A medida que se alcanza el equilibrio, las concentraciones son las mismas en ambos lados. En caso de difusión facilitada, el aumento en la concentración de las moléculas transportables en un lado de la membrana también da como resultado un aumento en la velocidad de transporte, hasta que todas las proteínas transportadoras están saturadas con tales moléculas.

En este punto, la tasa de difusión es máxima y esta tasa se mantiene hasta que las concentraciones en ambos lados sean iguales. Por tanto, tanto por difusión pasiva como por difusión facilitada, la concentración final es la misma. Pero como la difusión facilitada es un proceso más rápido, el equilibrio se alcanza más rápidamente.

Esto se muestra esquemáticamente en la figura 8.83:

Proceso # 3. Transporte activo:

El transporte activo de moléculas de nutrientes se diferencia básicamente de los procesos de difusión, ya sea pasivo o facilitado. En el proceso activo, el transporte a través de la membrana se produce contra el gradiente de concentración, es decir, de una concentración más baja a una concentración más alta del soluto. Tal transporte solo puede ocurrir con gasto de energía. En otras palabras, el transporte activo es siempre un proceso que consume energía (endergónico). En los sistemas biológicos, el transporte activo suele ser mucho más importante que los procesos de difusión.

La razón por la cual el transporte activo de moléculas de soluto de una concentración más baja a una más alta requiere un aporte de energía es comprensible a partir de los principios termodinámicos. Debido al aumento en la concentración de moléculas de soluto en la célula, la energía libre (G) aumenta porque la entropía (S) disminuye.

La relación entre los cambios de energía libre (∆G) y la entropía se expresa mediante la ecuación, ∆G = ∆H & # 8211 T∆S, donde H representa la entalpía (energía total del sistema) y T representa la temperatura absoluta. A medida que aumenta la concentración en la célula, la entropía disminuye porque las moléculas de soluto se acercan entre sí, lo que da como resultado su pérdida de libertad de movimiento.

Otros factores, es decir, H y T, permanecen iguales, una disminución en S significa un aumento en el valor de G, es decir, energía libre. Por tanto, el transporte activo conduce a una ganancia de energía libre (G). Un proceso que conduce a un aumento de la energía libre no puede ocurrir espontáneamente y solo puede ocurrir a través de la entrada de energía. Esta energía es suministrada por la hidrólisis de ATP o por la fuerza motriz del protón (PMF) generada por la concentración desigual de protones (H +) en ambos lados de la membrana.

La cantidad de energía (expresada en calorías) requerida en el transporte activo se puede calcular usando la ecuación AG = RT In C2/C1, donde ∆G representa la diferencia en energía libre, R la constante del gas (= 1,98), T la temperatura expresada como temperatura absoluta (273 + ° C), En el logaritmo natural (2,303 x log10), C2 la concentración del soluto dentro de la célula y Q la concentración del soluto en el exterior.

Ahora, en transporte activo C2 es mayor que C1 y, por tanto, el factor C2/C1 es siempre un número entero positivo. Esto significa que ∆G tiene un valor positivo. Un sistema que tiene un ∆G positivo no puede funcionar de forma espontánea. De la ecuación anterior, la cantidad de energía requerida para el transporte de 1 mol de un soluto no ionizado a través de una membrana que es permeable a la molécula de soluto, desde una concentración de 0.001 M a 0.1 M a una temperatura dada, digamos 30 ° C , se puede calcular

∆G = RT en C2/C1 = 1,98 x (273 + 30) x 2,303 logaritmo (0,1 / 0,001)

Para moléculas cargadas, es decir, iones y radicales, la ecuación anterior debe modificarse para adaptarse a otro gradiente además del gradiente de concentración, es decir, el gradiente de potencial eléctrico, porque este último también contribuye al cambio de energía libre en el sistema.

Al igual que la difusión facilitada, el transporte activo también implica la mediación de proteínas transportadoras presentes en la membrana celular. Es de suponer que estas proteínas funcionan de la misma forma que las implicadas en la difusión facilitada. Ellos, en virtud de tener una alta afinidad por el soluto transportable, se combinan con él y, por lo tanto, experimentan un cambio conformacional que pierde afinidad por las moléculas de soluto, lo que resulta en la liberación en el otro lado de la membrana.

Cuando un soluto particular tiene que ser transportado activamente usando la fuerza motriz del protón, la proteína transportadora se une tanto a H + como a las moléculas de soluto. Un ejemplo de este tipo de transporte lo proporciona la absorción de lactosa por E. coli. El transportador de lactosa (lactosa-permeasa) une las moléculas de H + y de lactosa y las transporta simultáneamente al interior de la célula (simportación).

Otro ejemplo se encuentra en el caso del transporte de glutamato en E. coli. En este caso, el transportador se une al glutamato en el exterior y lo transporta al interior, y se une al H + en el interior y lo expulsa al exterior (anti-puerto), de modo que la captación de glutamato está vinculada con la expulsión de H +.

(i) Transporte activo de lactosa en E. coli:

El transporte de lactosa en E. coli es un sistema inducible. Las bacterias que crecen en ausencia de lactosa no pueden transportar el azúcar a las células. Pero cuando se agrega lactosa al medio en sustitución de otros azúcares (como la glucosa), las bacterias desarrollan rápidamente la capacidad de transportar lactosa debido a una nueva síntesis de lactosa permeasa. Esta enzima es una proteína integral de la membrana que actúa como transportador de lactosa.

Se ha observado que el transporte de lactosa al interior de la célula va acompañado de un aumento del valor de pH del medio externo debido al agotamiento de los iones H +. Según la teoría quimiosmótica, la oxidación de los sustratos respiratorios conduce a la expulsión de H + fuera de la célula creando un gradiente de protones a través de la membrana celular que se utiliza para la síntesis de ATP. El gradiente de protones así creado es utilizado por E. coli también para la absorción de lactosa.

La molécula de lactosa permeasa contiene un sitio particular para unir lactosa y otro sitio para unir H +, y ambos sitios deben estar conectados para que la enzima sea funcional. La proteína permeasa atraviesa la membrana y se une tanto a la lactosa como al protón en la cara exterior.

Esta unión provoca un cambio en la conformación de la proteína y da como resultado la liberación tanto de lactosa como de H + dentro de la célula (simportación). Después de la liberación, la permeasa vuelve a su conformación original, lo que permite que se repita el ciclo. El gradiente de protones se mantiene mediante la expulsión de H + respiratoria.

La función de la lactosa permeasa en E. coli se muestra esquemáticamente en la figura 8.84:

(ii) Transporte de Na + y K + :

En la mayoría de los organismos biológicos, la concentración intracelular de K + es mayor que la del medio externo. Inversa es la situación en el caso de Na +. Se ha descubierto que la capacidad de las células para mantener tal concentración diferencial de Na + y K + frente al medio externo se debe a una enzima, Na + K + -ATPasa presente en la membrana.

Esta enzima requiere la presencia de Na + dentro de la célula y K + en el exterior para volverse funcional. Tiene un sitio de unión de ATP y otro sitio para unir Na + hacia su cara interna. En su cara exterior, la enzima tiene un sitio de unión a K +. Se ha sugerido que a medida que la enzima se une a Na + y ATP, induce una hidrólisis de ATP que da como resultado su cambio conformacional.

La conformación enzimática alterada pierde afinidad por el Na + que se libera al exterior pero, al mismo tiempo, la conformación alterada desarrolla afinidad por el K + que se transporta dentro de la célula. La unión de K + con la enzima provoca la desfosforilación (liberación de fosfato inorgánico) que devuelve la conformación original de la proteína enzimática y permite la unión de Na + y ATP. Una Na + K + & # 8211 ATPasa purificada es una glicoproteína que consta de dos subunidades grandes y dos pequeñas.

Las subunidades pequeñas tienen cadenas laterales de carbohidratos en su cara exterior (Fig. 8.85):

La expulsión activa de Na + por la actividad Na + K + -ATPasa crea un gradiente de Na + a través de la membrana que es utilizado por muchos microorganismos para la absorción activa de aminoácidos y azúcares. El transporte hacia el interior de estos compuestos se acompaña de la absorción simultánea de Na + que desciende por un gradiente de concentración, mientras que los aminoácidos y los azúcares se mueven contra un gradiente de concentración, es decir, de una concentración más baja (exterior) a una más alta (interior).

La mayor concentración exterior de Na + se mantiene mediante la expulsión activa de Na + a través de la actividad Na + K + -ATPasa. Las proteínas transportadoras específicas de aminoácidos o azúcares tienen dos sitios de unión, uno para el Na + y otro para el aminoácido o el azúcar. Solo cuando ambos sitios están ocupados por los respectivos ligandos, puede ocurrir el transporte (simportación).

Proceso # 4. Traslado de grupo:

La translocación de grupo es un tipo de transporte en el que la molécula transportable se altera químicamente a una forma impermeable durante su paso a través de la membrana citoplasmática. Debido a la transformación, la molécula queda atrapada en el citoplasma y no puede escapar.

El ejemplo más conocido de translocación de grupo es el sistema de fosfotransferasa (PTS) que se encuentra en una amplia variedad de bacterias para el transporte de azúcares. Se ha encontrado que el sistema funciona en E. coli, Salmonella, Vibrio, Staphylococcus, Clostridium, Fusobacterium, etc. Sin embargo, en algunas bacterias, como Azotobacter, Mycobacterium, Nocardia y Micrococcus, PTS está ausente.

Se ha descubierto que al menos tres proteínas diferentes están involucradas en el sistema de translocación de grupos de diferentes azúcares. Para algunos azúcares, como la glucosa, se requiere una proteína adicional. Estas proteínas son la enzima I, la enzima II y una pequeña proteína termoestable, llamada HPr. La proteína adicional para la glucosa es la enzima III.

Todas estas proteínas, excepto la enzima II, son citoplasmáticas. La enzima II es una proteína integral de membrana. También es diferente para el transporte de diferentes azúcares, mientras que la enzima I y HPr son comunes a todos los sistemas de transporte de azúcar. Estas proteínas sirven como una cadena de portadores en el PTS.

El funcionamiento de este sistema de translocación (PTS) comienza con la transferencia del grupo fosfato de alta energía del ácido fosfoenol pirúvico (PEP) a la enzima I (E-I) en el citoplasma de la célula bacteriana. A continuación, el grupo fosfato del E-I fosforilado (E-I-P) se transfiere a HPr, también una proteína citoplasmática, para producir HPr- (P). A continuación, el grupo fosfato se transfiere directamente a la enzima II (E-II) unida a la membrana o, en el caso del transporte de glucosa, a través de la enzima III (E-III).

Finalmente, el E-II o E-III fosforilado dona su grupo fosfato al azúcar que se transporta y el azúcar se libera en el citoplasma como su éster de fosfato. Por ejemplo, en el caso de la glucosa, es glucosa 6-fosfato. El fosfato de azúcar cargado negativamente evita que se escape a través de la membrana citoplasmática.

En el caso del manitol, la forma fosforilada en la que se libera es manitol-1-fosfato. Dado que la membrana es generalmente impermeable a las cargas moleculares, el PTS puede conducir a una alta concentración de fosfato de azúcar en el citoplasma, mientras que la concentración de azúcares es mucho menor en el medio externo. Por tanto, en PTS, los azúcares se traslocan contra un gradiente de concentración. Se trata, por tanto, de un tipo de transporte activo en el que la energía es aportada por el compuesto rico en energía PEP.

La enzima II es una proteína integral de membrana que es específica para el azúcar que se transporta. El PTS puede transportar muchos tipos diferentes de azúcares. Estos incluyen glucosa, galactosa, fructosa, pentosa & # 8217s, alcoholes de azúcar como manitol, ribitol y galactósidos. Para cada uno de estos compuestos, parece haber una enzima II diferente.

La pequeña proteína termoestable (HPr) del PTS tiene un peso molecular de 9.400 Dalton. Cuando HPr es fosforilado por E-I

(P), el grupo fosfato está unido a través de átomos de N de un residuo de histidina del HPr.

En la figura 8.86 se muestra una representación esquemática de la cadena de portadores en el funcionamiento del sistema de fosfotransferasa de bacterias:

Proceso # 5. Transporte de iones a través de ionóforos:

Ciertos compuestos antibióticos elaborados por micro

Los nismos pueden actuar como ionóforos cuando se integran en la membrana. Sin embargo, estos agentes no son componentes de transporte naturales de la membrana. Dos de estos agentes son la valinomicina producida por una especie de Streptomyces y la gramicidina producida por Bacillus brevis. El transporte de iones por estos ionóforos ha sido bien estudiado en mitocondrias aisladas.

La valinomicina es una molécula cíclica que consta de 12 moléculas alternas de D- o L-valina y L-lactato o D-hidroxiisovalerato. La estructura de la valinomicina se muestra en la figura 8.87A. La molécula circular de valinomicina tiene una periferia hidrofóbica que se adapta bien a la bicapa lipídica hidrofóbica de la membrana donde se inserta la valinomicina.

El núcleo central de la molecilo de valinomicina es hidrófilo y está cargado negativamente. El núcleo cargado negativamente puede unirse a cationes cargados positivamente.La valinomicina puede transportar específicamente K +, porque el tamaño es tal que encaja perfectamente en el núcleo central. La valinomicina transporta con menor eficacia Na + o Li +, porque su tamaño no coincide con el tamaño del núcleo central de la molécula.

Otro compuesto antibiótico, la no actina, también tiene una estructura circular y se sabe que transporta K + a través de la membrana mitocondrial.

Su estructura se muestra en la Fig. 8.87B:

Según una hipótesis, la valinomicina actúa como un portador y la molécula se difunde hacia adelante y hacia atrás a través de la bicapa lipídica de la membrana transportando K + a través de la membrana.

La carga positiva del ion está enmascarada por el núcleo cargado negativamente de la molécula de valinomicina (fig. 8.88):

La gramicidina A es un antibiótico polipeptídico que consta de una cadena lineal de 15 residuos de aminoácidos. Dos moléculas de gramicidina unidas por enlaces H en sus extremos N-terminales forman una hélice que atraviesa la membrana. A través del canal central de la hélice, cationes monovalentes como H +, NH4 +, K +, Na + y Li + pueden transportarse al interior de la celda.

El orden de preferencia de los iones transportables es el mencionado, es decir, H + tiene la preferencia más alta y Li + la más baja.

La estructura de la molécula de gramicidina A y la hélice postulada formada por un par de moléculas de gramicidina en la bicapa lipídica de la membrana se muestran en la figura 8.89 A y B:


INTRODUCCIÓN

Los receptores de manosa 6-fosfato (M6PR) entregan hidrolasas ácidas recién sintetizadas a la vía endocítica y luego regresan a la trans-Red de Golgi (TGN Storrie et al., 1984 Marrón et al., 1986 Duncan y Kornfeld, 1988 Kornfeld y Mellman, 1989). La ruta tomada por los complejos de hidrolasa ácida M6PR dentro de la ruta endocítica aún no se ha definido claramente pero, a partir de estudios de la distribución en estado estacionario de M6PR, generalmente se cree que estos receptores se concentran en un compartimento del endosoma al lisosoma. vía, que se ha llamado endosoma preliso o tardío (Griffiths et al., 1988, 1990 Kornfeld y Mellman, 1989). Este compartimento prelisosómico se etiqueta mal para reciclar receptores como el receptor de transferrina (TR), pero se puede marcar con sondas en fase líquida, que se administran de manera eficiente al lisosoma (Griffiths et al., 1988, 1990). En nuestros estudios anteriores en células HEp-2, hemos seguido el procesamiento de complejos de factor de crecimiento epidérmico-receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-EGFR) en ruta hacia el lisosoma (Felder et al., 1990 Hopkins et al., 1990 Futter et al., 1996). Después de la endocitosis, estos complejos se acumulan en cuerpos multivesiculares (MVB) que, cuando se forman por primera vez, contienen receptores de reciclaje como TR (Hopkins et al., 1990 van Deurs et al., 1993), y luego se someten a un proceso de maduración mediante el cual se eliminan los TR y se acumulan los EGF-EGFR. Luego, los MVB se fusionan directamente con los lisosomas preexistentes y comienza la degradación del EGF (van Deurs et al., 1995 Futter et al., 1996). M6PR se puede detectar durante la maduración de los MVB en células HEp-2 (van Deurs et al., 1993), pero ni el MVB maduro ni el lisosoma están enriquecidos en M6PR (Futter et al., 1996), lo que plantea la cuestión de cómo las M6PR entregan hidrolasas ácidas a la vía endocítica en las células HEp-2.

En estos estudios previos sobre la maduración de MVB en células HEp-2 (van Deurs et al., 1993, 1995 Futter et al., 1996), el tráfico de M6PR no se ha medido directamente. Por lo tanto, para determinar si la pequeña cantidad de M6PR que se puede detectar en el MVB en maduración (van Deurs et al., 1993 y el estudio actual) representa una ruta de tráfico importante de este receptor, hemos medido directamente el tráfico de una sola cohorte de M6PR independiente de cationes, o catepsina D (CD) transportada por M6PR, y hemos demostrado que una proporción significativa de M6PR y su ligando se transfieren a MVB que están procesando TR y EGFR de reciclaje. También mostramos que las M6PR fluyen rápidamente a través de las MVB en maduración sin acumularse en estas vacuolas y que en estado estable, las M6PR se concentran en dos sitios (el TGN y en las vacuolas en el citoplasma periférico), pero ninguno de los sitios está en la vía de procesamiento que lleva EGFR del endosoma al lisosoma.


DISCUSIÓN

Mediante el uso de microscopía TIRF y el sensor l-asp basado en FRET para establecer un ensayo funcional de vesícula única / transportador único, hicimos un seguimiento de las rotaciones únicas y múltiples en cientos de Glt individualesDoctorado transportadores simultáneamente. Desconvolucionamos la sincronización de los semiciclos de transporte y los ciclos completos para WT GltDoctorado y el mutante RSMR de ganancia de función y distribuciones amplias observadas de velocidades de transporte normalmente enmascaradas en las mediciones de actividad en masa. En WT GltDoctorado, identificamos al menos tres poblaciones cinéticamente distintas con tasas que varían en órdenes de magnitud. El tiempo de rotación predominante para WT GltDoctorado estaba en los cientos de segundos. Por tanto, en las mediciones a granel, la absorción de sustrato observada se debe principalmente a una pequeña fracción de los transportadores rápidos, y las tasas aparentes medidas no corresponden necesariamente a ningún transportador presente en la población. El aumento de la tasa de transporte en el mutante RSMR se debe principalmente al cambio de las poblaciones a favor de los transportadores rápidos.

Las distribuciones de los tiempos de transporte para el WT GltDoctorado y el mutante RSMR son paralelas a las distribuciones del tiempo de permanencia en el estado orientado hacia afuera de los transportadores unidos al sustrato obtenidos previamente en estudios de dinámica conformacional basados ​​en smFRET (9, 10), lo que sugiere que las distintas tasas de transporte son una consecuencia de distintas dinámicas conformacionales en los protómeros transportadores individuales durante las ventanas de observación. La distinción cinética entre transportadores rápidos, intermedios y lentos parece persistir durante múltiples ciclos de transporte con cambios poco frecuentes observados tanto en el ensayo de transporte como en la dinámica (9, 10). Este cambio de modo, a veces denominado "memoria molecular" o trastorno estático de las velocidades de reacción, se ha observado previamente en enzimas (1921), canales iónicos (2224), reacciones de plegamiento de proteínas (2932) y otros sistemas en los que se han implementado métodos de detección de una sola molécula. Normalmente, se desconoce la base estructural del trastorno de la frecuencia. Sin embargo, en un caso, las distintas tasas de plegamiento de proteínas, que persisten durante múltiples eventos de plegado / desplegado, se atribuyeron a una isomerización lenta de prolina (32). Mientras que los cimientos estructurales de los modos funcionales de GltDoctorado no se conocen, es notable que la proteína se origina a partir de una arqueona hipertermofílica y funciona de forma nativa a ca. 100 ° C. Parece posible que distintos estados estructurales de baja entalpía se “congelen” a temperatura ambiente y experimenten interconversiones muy lentas.

La combinación de un enfoque de una sola molécula que sondea las transiciones conformacionales y un ensayo funcional de una sola molécula proporciona un enfoque poderoso y potencialmente generalizable para acceder a la relación entre la dinámica y la función de los transportadores. La aplicación de estos enfoques a una gama más amplia de sistemas, y en particular a los transportadores de glutamato humano que desempeñan funciones críticas en la neurotransmisión glutamatérgica, probablemente aportará conocimientos desconocidos sobre la base dinámica de su actividad y tal vez sugiera medios previamente no identificados de su regulación farmacológica.


Discusión

La dinámica de la vía secretora se ha abordado históricamente utilizando una variedad de técnicas. De hecho, los artículos clásicos de Palade (Jamieson y Palade, 1967 Palade, 1975) sobre la vía pancreática exocrina incluyen varios cursos de tiempo basados ​​en la aparición de partículas autorradiográficas sobre estructuras celulares identificadas por microscopía electrónica. Posteriormente, se utilizaron aminoácidos radiomarcados como trazadores para estudiar la síntesis, procesamiento y transporte de proteínas de membrana secretoras e integrales (Scheele et al., 1978 Lodish et al., 1983 Fries et al., 1984). Esto requirió idear métodos de homogeneización celular, enzimas marcadoras, gradientes de sacarosa y geles de poliacrilamida. Estas y otras técnicas han contribuido y están contribuyendo a nuestra comprensión de la cinética de la vía secretora, pero ha habido una serie de problemas aparentemente insuperables. Aunque la sala de emergencias es más densa que cis-Golgi, y cis-Golgi es más denso que medial, y así sucesivamente, en el orden precursor-producto de la membrana plasmática, ha permanecido imposible preparar fracciones puras de orgánulos celulares particulares. Aunque las enzimas marcadoras se concentran en determinadas fracciones, al aislarlas se distribuyen de forma más o menos gaussiana a lo largo del espectro de compartimentos de la vía secretora. Esto ha hecho que sea difícil saber con certeza dónde se encuentra en la célula la proteína marcada aislada en el gel. Además, la bioquímica de estas técnicas es enormemente laboriosa. En consecuencia, es extremadamente raro encontrar un curso temporal de más de seis puntos de datos para fracciones de células en la literatura sobre tráfico de proteínas (Fries et al., 1984 Scheele y Tartakoff, 1985 Green et al., 1987).

En este artículo, aplicamos una técnica desarrollada recientemente para estudiar la dinámica del tráfico secretor: imágenes de lapso de tiempo de fluorescencia de proteínas etiquetadas con GFP en células vivas. Las quimeras de GFP se expresan fácilmente dentro de las células, son brillantes y se pueden obtener imágenes repetitivamente sin un fotoblanqueo significativo utilizando técnicas de microscopía de fluorescencia convencionales (Cubitt et al., 1995 Sullivan y Shelby, 1998 Piston et al., 1998). También se puede demostrar que la etiqueta GFP no altera el transporte o la función de las proteínas (Lippincott-Schwartz et al., 1998). Esto los hace ideales para rastrear proteínas a través de vías intracelulares. Los cursos de tiempo esencialmente continuos producidos por las imágenes de lapso de tiempo de fluorescencia de las quimeras de GFP permiten mediciones detalladas sin precedentes de las características cinéticas de la vía secretora. Esto, a su vez, proporciona la base para abordar por primera vez en células vivas individuales cuestiones clave como cuánto tiempo pasa una proteína típica en un compartimento particular como el complejo de Golgi, dónde se encuentran los pasos más lentos de la vía secretora y cuáles los pasos están sujetos a control farmacológico o fisiológico.

Modelado cinético del transporte de proteínas secretoras

Los datos cinéticos para el transporte de VSVG-GFP a través de la vía secretora se obtuvieron a partir de experimentos de imágenes de lapso de tiempo de células individuales en condiciones en las que todas las moléculas de VSVG-GFP fluorescentes podían detectarse en cualquier momento. Se midieron y representaron los cambios temporales en el número de moléculas de VSVG-GFP dentro de las ROI que abarcan la región de Golgi yuxtanuclear y la célula completa. Descubrimos que un modelo simple compuesto por una serie de leyes de velocidad lineal que conectan tres compartimentos (ER, complejo de Golgi y membrana plasmática) era suficiente para ajustar los datos. Leyes de velocidad no lineales más complejas (por ejemplo, Michaelis-Menten) que implican una constante de velocidad variable (o coeficiente de velocidad) a medida que la concentración de VSVG-GFP en diferentes compartimentos pasó de alta (al principio del experimento) a baja (al final del experimento) ) no fueron necesarios. Más bien, en todo momento, VSVG-GFP se movió entre compartimentos a una tasa igual a una constante de tasa (KER, KGRAMO, y KPM) multiplicado por la cantidad de VSVG-GFP en el compartimento donante.

La capacidad de ajustar los datos cinéticos a las leyes de velocidad lineal indicó que, en nuestras condiciones experimentales, VSVG-GFP no pasó ningún límite de saturación y que los mecanismos reguladores en su conjunto permanecieron constantes. Combinando el análisis cinético con la relación conocida entre la intensidad de la fluorescencia y el número de moléculas, obtuvimos estimaciones de los flujos pico de VSVG-GFP que salen de cada orgánulo. En una célula que expresa 2 × 10 7 moléculas de VSVG– GFP, el flujo de salida de ER pico fue de ~ 7 000 moléculas de VSVG– GFP / s. La salida máxima del Golgi fue de 4.000 moléculas / s, y la internalización / degradación de la membrana plasmática alcanzó un máximo de 700 moléculas / s. Estas tasas de transporte son las primeras que se informan para una proteína específica en células vivas individuales.

Es interesante comparar los flujos máximos de VSVG– GFP en los tres compartimentos secretores en nuestro modelo para los datos de la Fig. 2, con los necesarios para que la célula duplique su tamaño cada 20 h. Suponiendo dos lípidos por 1 nm 2, una densidad de proteína a lípido de 1:50 típica de la membrana plasmática (Alberts et al., 1994), y un área característica de la membrana plasmática de 2,5 × 10 3 μm 2 (Griffiths et al., 1986), inferimos que la célula tiene que sintetizar un mínimo de 1400 proteínas de la membrana plasmática por segundo. Si se considera el recambio de proteínas, este número sería varias veces mayor. Por tanto, nuestro pico de flujo de ER a Golgi de 7.000 por segundo o de Golgi a la membrana plasmática de 4.000 por segundo son grandes, pero no eclipsan el flujo secretor basal.

Aunque ajustamos los datos de imágenes de lapso de tiempo a un modelo simple que consta de tres compartimentos y tres constantes de velocidad, cada una de estas constantes de velocidad resume numerosos procesos bioquímicos que ocurren en lo que, de hecho, son orgánulos heterogéneos. KER incluye los procesos involucrados en el plegado y clasificación de VSVG-GFP en el ER, así como los necesarios para la entrega de VSVG-GFP al complejo de Golgi. KGRAMO representa todos los pasos entre la entrada en el complejo de Golgi y la entrega a la membrana plasmática, incluido el transporte intra-Golgi (por ejemplo, modificación de carbohidratos y transporte entre cisternas), pasos de clasificación / empaquetado en el TGN y tráfico de PGC. KPM abarca los eventos de tráfico que ocurren en la membrana plasmática, incluida la internalización y la degradación. El hecho de que las leyes de velocidad lineal puedan resumir cada uno de estos conjuntos de procesos como una constante de velocidad única sugiere que, dentro de cada conjunto, los procesos se pueden caracterizar eficazmente mediante un solo paso limitante de la velocidad y que ni la identidad ni las características cuantitativas de este El paso de limitación de velocidad se ve perturbado por el tráfico de VSVG-GFP.

Modelos de tráfico que fracasan

El modelado cinético es una herramienta para probar hipótesis cuantitativas. En la sección anterior, describimos el modelo más simple que es consistente con todos nuestros datos experimentales. Aquí, enumeramos brevemente varias hipótesis que fueron probadas y consideradas deficientes. El primer modelo alternativo no incluyó la internalización y degradación de VSVG-GFP de la membrana plasmática. Probamos esta idea eliminando KPM y reacondicionamiento de los datos experimentales. En todos los casos, pero especialmente en los experimentos de 10 h, este modelo no tuvo en cuenta la pendiente final de la fluorescencia celular total. También probamos la posibilidad de que la lenta disminución de la fluorescencia celular total durante 10 h se debiera al fotoblanqueo o degradación de VSVG-GFP de múltiples compartimentos celulares. Esta hipótesis se probó cuantitativamente al permitir la pérdida de fluorescencia de cada compartimento celular a una velocidad única. Este modelo no tuvo en cuenta la mayoría de los conjuntos de datos. Además, tenemos la demostración experimental directa de que la fluorescencia celular total no disminuye con el tiempo durante la obtención de imágenes en las células tratadas con BFA para evitar la exportación de VSVG-GFP fuera del RE o en células fijas. Los modelos que involucran un compartimiento de reciclaje lento de Golgi en lugar de la vía de degradación, o modelos que colocan el paso limitante de la velocidad para la internalización / degradación en endosomas tardíos (localizados en el ROI de Golgi) en lugar de en la membrana plasmática, tampoco podrían explicar la pendiente terminal del Golgi y la fluorescencia celular total.

Se probaron varias otras vías de tráfico y se descubrió que no tenían solución. Esto significa que eran consistentes con los datos disponibles, pero los datos contenían información insuficiente para estimar las constantes de velocidad correspondientes. Por ejemplo, no pudimos resolver un compartimento intermedio post-Golgi excepto en el experimento (Fig. 7) diseñado específicamente para el análisis de PGC y eventos de fusión. Tampoco pudimos resolver el posible tráfico retrógrado de VSVG-GFP desde Golgi a los experimentos de ER en los que el ER puede resolverse desde la membrana plasmática probablemente será esencial para cuantificar cualquier tráfico retrógrado de VSVG-GFP.

En resumen, hemos formulado y probado muchos modelos cinéticos fisiológicamente razonables del tráfico de VSVG. El modelo presentado en la Fig.2,A representa el modelo más simple que es cuantitativamente consistente con nuestros datos experimentales sobre el tráfico de VSVG-GFP en células COS. Con enfoques de imágenes adicionales, anticipamos que será posible refinar este modelo para caracterizar vías específicas con más detalle. Por ejemplo, en la Fig. 7 mostramos cómo el fotoblanqueo combinado con imágenes de alta resolución puede usarse para resaltar los intermediarios de transporte involucrados en el tráfico de Golgi a la membrana plasmática. Mediante el modelado cinético de los datos, pudimos calcular la fracción del transporte total de Golgi a la superficie celular de VSVG– GFP que ocurre por las PGC, y estimar la vida útil de las PGC dentro de las células.

Constantes de tarifas para el tráfico de VSVG-GFP

Las constantes de velocidad representan la característica cinética fundamental de cualquier proceso porque describen la fracción del material que se mueve a través del proceso por unidad de tiempo. Para el transporte de ER a Golgi, la constante de velocidad media para VSVG-GFP fue de 2.8% por min, para el transporte de Golgi a la membrana plasmática fue de 3.0% por min y para el transporte desde la membrana plasmática a un sitio de degradación fue de 0.25% por min . Las constantes de velocidad miden el número de moléculas de carga movidas por tiempo normalizado por el número de moléculas que quedan por mover. Esta es la razón por la que los cambios en las constantes de velocidad son cambios informativos que ocurren solo cuando las no linealidades, como la saturación y la regulación fisiológica, se reflejan en los datos. En la Tabla I, por ejemplo, informamos una disminución significativa en la constante de la tasa de salida de Golgi causada por el tratamiento con el cito B. ningún efecto sobre la constante de tasa de salida de Golgi. En cambio, la disminución en KGRAMO debe deberse a un cambio regulatorio en la función de Golgi o en los mecanismos de exportación.

La precisión de nuestras constantes de tasa estimadas para el tráfico de VSVG– GFP no tiene precedentes. Los coeficientes de variación variaron de 2,1 a 5,0% dependiendo de la constante de tasa particular. Por el contrario, la cinética de persecución del pulso de aminoácidos radiomarcados combinada con el fraccionamiento celular y la inmunoprecipitación (que representa el estado de la técnica anterior en la cinética del tráfico secretor) suelen producir una precisión en el rango de 30 a 50% y, por lo tanto, son de un orden de magnitud. menos precisos (Fries et al., 1984 Scheel y Tartakoff, 1985 Green et al., 1987). Esta precisión de nuestro método de imágenes GFP surge de dos fuentes principales. Primero, estamos recopilando cientos de puntos de datos de la misma celda, en lugar de seis puntos de datos promediados sobre miles de células diferentes, como es típico en los análisis cinéticos bioquímicos.En segundo lugar, nuestra "fracción" de Golgi (es decir, un sitio espacial dentro de una sola célula) está excepcionalmente bien definida, en contraste con el aislamiento bioquímico de las fracciones de Golgi de gradientes donde la contaminación con otras fracciones de orgánulos es inevitable.

Las diferencias en las constantes de velocidad a niveles de expresión bajos y altos de VSVG-GFP que observamos cuando las células se incubaron en períodos cortos o largos a 40 ° C son significativas. Una posible explicación de esto es que los diferentes niveles de expresión conducen a cambios físicos en el tamaño o la morfología de los compartimentos que dan como resultado diferentes velocidades de transporte. Por ejemplo, si la relación entre el área de superficie de ER y los sitios de salida de ER aumenta con tiempos de incubación más largos a 40 ° C, VSVG-GFP podría tardar más en encontrar los sitios de salida de ER al cambiar a temperatura permisiva, lo que da como resultado un valor más bajo de KER. Esto es diferente de la posibilidad de que las células de mayor expresión estén cerca de la saturación para algún componente de transporte. Si eso fuera cierto, entonces habría algún punto en el experimento de alta expresión en el que la abundancia de VSVG-GFP en las membranas de ER y Golgi caiga a los niveles de los experimentos de baja expresión. En este punto, la constante de velocidad que caracteriza el proceso de transporte en las células de mayor expresión debería cambiar a la de las células de menor expresión. No observamos esto. Constantes de velocidad distintas, KER, KGRAMO, y KPM se identificaron en las células de alta y baja expresión y no cambiaron a medida que la concentración de VSVG-GFP pasó de alta (al principio del experimento) a baja (al final del experimento). Debido a que los procesos de transporte fueron lineales a lo largo del experimento, ningún paso en el transporte de VSVG-GFP estuvo saturado en las células de alta y baja expresión.

Sobre la naturaleza de los pasos que limitan la velocidad del tráfico de VSVG-GFP

El hecho de que las leyes de velocidad lineal puedan describir con precisión los procesos subyacentes a cada una de nuestras constantes de velocidad es algo sorprendente dada la superficie sustancial de la membrana que probablemente transite con VSVG-GFP a través de la vía secretora. Si asumimos que una proteína transmembrana como VSVG-GFP está rodeada por una capa de 50 lípidos (Edidin, 1997) y que dos lípidos ocupan 1 nm 2, entonces para la célula analizada en la figura 2, con 2 × 10 7 moléculas de VSVG-GFP, se necesitan aproximadamente 500 μm 2 de lípido para transportar VSVG-GFP a la membrana plasmática, y se agrega una cantidad similar de área a la membrana plasmática. Nuestro hallazgo sugiere que esta cantidad de membrana es significativa en relación con el área de superficie total de la membrana plasmática en estas células, de que entre 60 y 100 min después del cambio a la temperatura permisiva, coincidiendo con la llegada de VSVG-GFP a la superficie, el La membrana plasmática comenzó a agitarse y expandirse de tamaño (ver Fig. 1 y película Quicktime). El área del RE es muchas veces el área de la membrana plasmática (DePierre et al., 1988), por lo que la sobreexpresión de VSVG-GFP probablemente no sea una perturbación relativamente grande para el RE. Por otro lado, se estima que el área de superficie del complejo de Golgi es menor que la membrana plasmática (Griffiths et al., 1986), por lo que es probable que el paso de VSVG-GFP y su lípido acompañante a través del Golgi aumente el tamaño. de este orgánulo.

Suponiendo que la cantidad de membrana entregada al Golgi después de la liberación de VSVG-GFP es una fracción significativa de la que normalmente está presente, la linealidad que descubrimos en la cinética de VSVG-GFP proporciona una pista importante sobre la naturaleza del paso de limitación de velocidad para la exportación de Golgi. Si el paso de limitación de velocidad para la exportación de Golgi implicara una reacción binaria simple entre VSVG-GFP y algún componente de Golgi (p. Ej., Una enzima de Golgi o un componente regulador), esperaríamos KGRAMO para variar inversamente con el área de superficie de la membrana del Golgi. Esto se debe a que la concentración efectiva de la maquinaria de procesamiento / regulación se diluiría transitoriamente por la membrana asociada a VSVG-GFP entrante. Debido a que el transporte de VSVG-GFP no muestra tales efectos de dilución no lineal, la vía secretora parece haber desarrollado mecanismos que aíslan los pasos de procesamiento / transporte de proteínas de los caprichos del exceso de tráfico de membrana.

Una forma de obtener una velocidad que no variaría cuando se diluye una enzima de procesamiento o un componente de transporte es mediante la separación de fases (Siggia, 1979). Este fenómeno puede ocurrir de manera uniforme dentro de un compartimento, con el tiempo necesario para crear un dominio "separado de fase" en función del tamaño del dominio y no del tamaño del compartimento. Es probable que la separación de fases sea una propiedad del sistema proteína-lípido en conjunto (p. Ej., Las proteínas con una determinada longitud / composición transmembrana prefieren lípidos de una determinada clase [Mouritsen y Bloom, 1993 Bretscher y Munro, 1996]). Podría ocurrir cuando se introduce material en el Golgi, y los componentes del ER se reciclan de regreso al interior del Golgi cuando, como resultado del procesamiento de carbohidratos, ciertas especies que eran miscibles ya no lo son o en el nivel de TGN donde las proteínas se clasifican para la exportación. Las ideas recientes sobre microdominios y "balsas" dentro del complejo de Golgi están de acuerdo con la idea de separación de fases (Harder et al., 1997 Edidin, 1997). Debido a que representa una categoría de fenómeno que no responde a la dilución, la separación de fases permitiría que los procesos de transporte de Golgi acomoden el material ER entrante de manera eficiente, sea cual sea el tamaño.

Exportación de VSVG-GFP mediada por túbulos desde el complejo de Golgi

La visualización de la exportación de VSVG-GFP del complejo de Golgi mediante imágenes de alta resolución de la región de Golgi 50 min después del cambio a la temperatura permisiva reveló procesos de túbulos largos que contenían VSVG-GFP que se desprendieron y separaron del complejo de Golgi. Estas estructuras no fueron un artefacto de la expresión de VSVG-GFP, ya que se observaron a niveles altos y bajos de expresión de VSVG-GFP en diversos tipos de células, y también se observaron en células que expresan otras quimeras de GFP (incluida la cromogranina B humana y VSVG soluble, datos no mostrados). Más bien, los procesos de los túbulos parecían servir como vehículos para la exportación de proteínas del complejo de Golgi. Los túbulos de Golgi se han implicado previamente en la exportación de proteínas del complejo de Golgi. Los estudios de imágenes de lapso de tiempo de células vivas marcadas con NBD-ceramida (que se inserta preferentemente en las membranas de TGN, Lipsky y Pagano, 1985) revelaron numerosos procesos de túbulos que se extienden desde el complejo de Golgi (Cooper et al., 1990). Además, los estudios de microscopía electrónica han demostrado que los túbulos en el trans- Las caras del Golgi son numerosas y parecen "desprenderse" de las cisternas de Golgi apiladas muy cerca (Rambourg et al., 1979 Roth et al., 1985 Griffiths y Simons, 1986 Ladinsky et al., 1994). De hecho, Ladinsky et al. (1994) encontraron que la mayoría de los perfiles vesiculares adyacentes al TGN observados en secciones delgadas individuales eran, de hecho, túbulos conectados al TGN cuando se reconstruían en tres dimensiones. Estas observaciones, combinadas con los datos de imágenes de lapso de tiempo de VSVG-GFP que se informan aquí, sugieren que el crecimiento y desprendimiento del túbulo de Golgi son mecanismos fundamentales para la exportación de proteínas de membrana fuera del complejo de Golgi.

Dado el papel de los túbulos en la exportación de Golgi, ¿qué se puede decir sobre su formación y desprendimiento de las membranas de Golgi? Nuestro hallazgo de que el nocodazol no afecta significativamente la exportación de VSVG-GFP del complejo de Golgi implica que los túbulos involucrados en la exportación de Golgi no requieren microtúbulos para formarse o separarse del complejo de Golgi. Más bien, los microtúbulos parecen desempeñar un papel solo en la extensión periférica y la translocación de estas estructuras. El retraso de la salida de VSVG-GFP del Golgi en células tratadas con cito B, por el contrario, implica que los elementos citoesqueléticos basados ​​en actina facilitan la exportación de proteínas del complejo de Golgi (Fath y Burgess, 1993 Musch et al., 1997). Curiosamente, los túbulos derivados de Golgi se formaron en las células tratadas con cito B, pero fueron significativamente más largos que en las células no tratadas (datos no mostrados), lo que sugiere que los componentes citoesqueléticos basados ​​en actina podrían estar involucrados en el desprendimiento de estos intermediarios de transporte (Musch et al. , 1997). El hallazgo de que AlF abolió todas las exportaciones de VSVG-GFP del complejo de Golgi sugiere que los componentes sensibles a AlF subyacen a la exportación de proteínas de Golgi, y es consistente con el trabajo de Melancon et al. (1987) y Yoshimori et al. (1996). Queda por determinar si AlF bloquea la exportación de proteínas del Golgi al evitar la clasificación de VSVG-GFP a los sitios de salida de Golgi (por ejemplo, por vesiculación de las membranas de Golgi inducida por la unión masiva de proteínas de la cubierta periférica) o por algún otro mecanismo.

El hecho de que las proteínas de la cubierta de Golgi β-COP y AP1 no se localizaran en los túbulos que contienen VSVG-GFP sugiere que estas proteínas no están directamente involucradas en la formación de los túbulos. Si se identificarán o no otras proteínas de la cubierta que se localizan en los túbulos y regulan su función, se debe abordar en trabajos futuros. Sin embargo, se deben considerar mecanismos alternativos para la gemación de estas estructuras a los que se basan simplemente en el reclutamiento y la envoltura del pelaje. Las ideas recientes sobre la clasificación basada en lípidos en el TGN proporcionan un modelo posible de cómo las VSVG-GFP podrían clasificarse en los procesos de los túbulos (Harder y Simons, 1997).

Una cuestión importante es si la clasificación de VSVG– GFP ocurre antes o durante la formación de los túbulos y qué relación existe entre la clasificación de proteínas y la tubulación en el TGN (Geuze y Morre, 1991 Griffiths y Simons, 1992 Ladinsky et al., 1994). La presencia de dinamina (una GTPasa) en las membranas de Golgi plantea la posibilidad de que esta proteína pueda tener algún papel en la formación y / o desprendimiento de los túbulos de Golgi (Jones et al., 1998). Los estudios in vitro han demostrado que la dinamina puede convertir los liposomas en túbulos que se cortan con la adición de GTP (Sweitzer y Hinshaw, 1998 Takei et al., 1998). Debido a que la formación de túbulos y el desprendimiento de las membranas de Golgi son procesos dinámicos que ocurren en una escala de tiempo rápida, estudios de imágenes de lapso de tiempo de diferentes cargas y proteínas unidas periféricamente asociadas con los túbulos de Golgi que se obtienen simultáneamente en las células utilizando quimeras de GFP que excitan / emiten en diferentes Las longitudes de onda de la luz (Heim y Tsien, 1996 Rizzuto et al., 1996 Ellenberg et al., 1998 Zimmermann et al., 1998) deberían ser herramientas importantes para abordar estas preguntas.

Caracterización de PGC

Después de desprenderse del complejo de Golgi, los elementos de los túbulos que contienen VSVG-GFP típicamente se movieron hacia la periferia celular y sufrieron cambios de forma dramáticos (extendiéndose como túbulos y luego retrayéndose en cuerpos esféricos) durante el transporte. El movimiento de estas CGP fue saltatorio y se produjo a una velocidad máxima de 2,7 μm / s. El hecho de que el nocodazol, pero no el cito B, bloqueara el movimiento de las PGC indicaba que estas estructuras se movían a lo largo de pistas de microtúbulos en lugar de un sistema citoesquelético basado en actina. Estas observaciones son similares a las obtenidas de otros estudios que han examinado el transporte exocítico de carga secretora (Wacker et al., 1997 Nakata et al., 1998 Toomre et al., 1998). En esos estudios, así como en el nuestro, el movimiento neto de las estructuras posteriores al Golgi fue hacia afuera desde la región de Golgi hacia la periferia celular. Esto sugirió que estaba involucrada la proteína motora de microtúbulos dirigida al extremo positivo, la kinesina. Este movimiento contrastó con el movimiento uniforme menos dirigido al final observado para las estructuras pre-Golgi que transportan VSVG-GFP (Presley et al., 1997 Scales et al., 1997) que se ha propuesto que está mediado por dineína citoplasmática (Presley et al. , 1997 Burkhardt, 1998). Entender la identidad de estas proteínas motoras dirigidas al extremo positivo y negativo (y sus componentes asociados) y comprender cómo coordinan el tráfico de membrana hacia y desde el complejo de Golgi es un desafío importante para el trabajo futuro.

Aunque el movimiento de las PGC fue inhibido por la despolimerización de los microtúbulos, encontramos que VSVG-GFP todavía se administraba a la membrana plasmática en estas condiciones. Una explicación de este hallazgo es que el tipo de célula utilizado en estos experimentos (es decir, COS) es muy plano, con una distancia de sólo 1 a 2 μm entre el complejo de Golgi y / o PGC a la membrana plasmática suprayacente. Por tanto, es probable que la liberación de VSVG-GFP a la membrana plasmática después de la rotura de los microtúbulos se produzca por difusión aleatoria de las PGC y su fusión con los sitios cercanos de la membrana plasmática.

Nuestras técnicas de imágenes cuantitativas demostraron que las PGC enriquecidas en VSVG-GFP eran grandes (ocupaban un área promedio de 1,3 μm 2) y que transportaban una cantidad significativa de carga de VSVG-GFP. Durante el flujo máximo de VSVG-GFP fuera del complejo de Golgi, por ejemplo, las PGC individuales transportaron un promedio de 10,000 moléculas de VSVG-GFP. Nakata et al. Han observado estructuras exocíticas de tamaño similar. (1998) en sus estudios de imágenes utilizando proteínas secretoras marcadas con GFP.

Descubrimos que las PGC eran el vehículo principal para la entrega de VSVG-GFP a la superficie celular. En experimentos en los que se midió la evolución temporal de la aparición de VSVG-GFP en una región fotoblanqueada fuera del complejo de Golgi, más del 60% de la fluorescencia celular que reapareció lo hizo a través de las PGC. En lugar de la difusión de pequeñas vesículas en la caja fotoblanqueada, gran parte del porcentaje restante de fluorescencia que se recuperó probablemente se derivó de las PGC que se fusionaron con la membrana plasmática en áreas fuera de la caja fotoblanqueada, lo que permitió que VSVG-GFP se moviera por difusión lateral a lo largo de la superficie celular en la caja fotoblanqueada. De acuerdo con esta posibilidad, la recuperación de la reserva restante de VSVG-GFP en el área fotoblanqueada fue más de 15 veces más rápida que el movimiento de PGC (y presumiblemente vesículas) dentro del citoplasma. A partir de estos experimentos, también pudimos determinar que las PGC tienen una vida media de ~ 3,8 min en las células COS. Además, pudimos demostrar que las PGC que llevan VSVG-GFP se fusionan directamente con la membrana plasmática sin cruzarse con otras vías de membrana en la célula.

La capacidad de visualizar y modelar cinéticamente el tráfico de proteínas en células individuales utilizando la tecnología GFP proporciona un nuevo enfoque poderoso para abordar numerosas preguntas relevantes para la regulación y el funcionamiento de la vía secretora. ¿Diferentes moléculas de carga atraviesan el complejo de Golgi a velocidades similares, como lo predicen los modelos de progresión cisternal? ¿Hay retrasos en el transporte entre los supuestos subcompartimentos de Golgi? ¿Qué pasos de la trata se ven afectados por la perturbación en la maquinaria de la trata y están sujetos a control farmacológico? Las ventajas duales de la cuantificación y la experimentación in vivo utilizando construcciones de GFP deberían permitir el análisis de estas cuestiones centrales sobre la función de la membrana y el tráfico. Por ejemplo, el fotoblanqueo de quimeras de GFP se puede combinar con el análisis cinético para definir una nueva subpoblación de membranas o resaltar un intermedio. El uso de variantes de GFP de dos colores en estudios de doble marcaje, ahora técnicamente factible (Rizzuto et al., 1996 Ellenberg et al., 1998 Zimmermann et al., 1998), agrega más capacidades. Estos enfoques están ampliando nuestra comprensión de la dinámica de las vías secretoras y prometen arrojar nueva luz sobre cómo funciona la maquinaria molecular en todo el sistema dentro de las membranas secretoras de las células vivas.


Discusión

Hasta la fecha se han clonado cinco subtipos de transportadores de glutamato. Las propiedades funcionales de los subtipos de transportadores 1-3, que se han estudiado ampliamente, son muy similares entre sí, incluida su cinética de transporte de glutamato. Por tanto, surge la pregunta: ¿Por qué necesitamos tantos subtipos diferentes?

Aquí, informamos por primera vez que algunas de las características funcionales del subtipo EAAT4 son dramáticamente diferentes de las de los subtipos 1-3, aunque los transportadores comparten un mecanismo de transporte común. El primer hallazgo nuevo de este estudio es que el subtipo de transportador de glutamato EAAT4 opera de 5 a 10 veces más lentamente que los subtipos de transportador EAAT 1-3 (los parámetros cinéticos se resumen en la Tabla II). En segundo lugar, el transporte de EAAT4 tiene una dependencia significativamente diferente del potencial transmembrana que los subtipos 2 y 3. Por ejemplo, EAAT4 se inhibe a voltajes muy negativos y la afinidad aparente de EAAT4 por el glutamato depende del voltaje, mientras que la de EAAT 2 y 3 es independiente del voltaje (Wadiche et al., 1995b Grewer et al., 2000). En tercer lugar, las afinidades de EAAT4 por el glutamato y el ion Na + cotransportado son significativamente más altas que las de EAAC1 (Grewer et al., 2000 Watzke et al., 2001).

Mecanismo de transporte de glutamato por EAAT4

El mecanismo general de transporte de sustrato por EAAT4 es muy similar a los de los subtipos de transportadores previamente caracterizados. En cuanto a los EAAT 2 y 3, el transporte de glutamato se basa en un mecanismo secuencial en el que el glutamato y el Na + se translocan en el mismo paso de reacción, mientras que el K + se contratransporta en la reacción de reubicación del transportador sin glutamato. Por tanto, la translocación del glutamato todavía puede tener lugar en ausencia total de K + intracelular, mientras que el recambio en el estado estacionario se inhibe en estas condiciones. Suponemos que la corriente aniónica en estado estable está principalmente limitada por la transición de T 'a T dependiente de K + en el Esquema 1. Los distintos efectos de Na + y K + sobre el transporte de glutamato por EAAT4 se destacan por sus diferentes efectos sobre el Corriente preestablecida EAAT4. En ausencia virtual de K + intracelular, las corrientes aniónicas transitorias inducidas por glutamato todavía están presentes (asociadas con la N que transloca glutamato2TG a N2Transición de T'G en el esquema 1), pero el componente de corriente aniónica en estado estacionario se suprime (Fig. 6 C). Por el contrario, las concentraciones bajas de Na + extracelular dan como resultado la inhibición del componente de corriente aniónica inducida por glutamato transitoria, pero todavía se observa corriente en estado estable (Fig. 6 D). Estos resultados indican que la reacción de reubicación inducida por K + se convierte en una limitación de la velocidad para el recambio en estado estacionario con una [K +] intracelular baja, mientras que la reacción de translocación dependiente de Na + se convierte en una limitación de la velocidad con una [Na +] extracelular baja.

Como en EAAC1, la unión de Na + y glutamato a EAAT4 es secuencial (Watzke et al., 2001). El glutamato interactúa con EAAT4 solo después de que se une un primer ion Na +. A partir de entonces, la unión del glutamato genera un segundo sitio de unión de alta afinidad para el Na + en el transportador. La principal evidencia de este mecanismo de unión secuencial de Na + -glutamato-Na + proviene de la dependencia de [Na +] determinada experimentalmente de la corriente máxima inducida por glutamato a concentraciones saturadas de glutamato (Imax), que disminuye a bajas concentraciones de sodio, lo que muestra que al menos un Na + debe unirse al transportador después de que se une el glutamato. Por el contrario, si todos los iones de Na + cotransportados se unieran a EAAT4 antes que al glutamato, se esperaría que Imax es independiente de la concentración de Na + (Watzke et al., 2001).En este caso, a menos que la unión de Na + se convierta en un factor limitante para el transporte en estado estable a [Na +] muy bajo, se esperaría que las concentraciones de glutamato saturado empujen el equilibrio de unión de Na + hacia la forma unida, superando así el efecto inhibidor de la [ Na +] en la tasa de transporte de estado estacionario. Nuestros resultados también imponen un límite en la estequiometría de Na +: cotransporte de glutamato de EAAT4, que no se ha determinado experimentalmente hasta ahora. Esta estequiometría de acoplamiento es al menos glutamato 2 Na +: 1, pero es probable que sea la misma que la estequiometría 3: 1 de las EAAT 2 y 3 (Zerangue y Kavanaugh, 1996 Levy et al., 1998).

La tasa de absorción de glutamato en estado estacionario aumentó algo en presencia de SCN, en ambos lados de la membrana. Este efecto sugiere que SCN - como anión caotrópico puede tener un papel modulador en el transporte de glutamato por EAAT4. Aunque las constantes de velocidad determinadas a partir del análisis cinético de estado preestablecido para la rama de translocación de glutamato del ciclo fueron las mismas en ausencia y presencia de SCN - (Fig.8 D), se puede plantear la hipótesis de que el anión afecta la velocidad de la velocidad. etapa limitante del ciclo de transporte en la rama dependiente del potasio. Serán necesarios experimentos adicionales para probar esta hipótesis. Sin embargo, estos resultados muestran que es importante tener cuidado al interpretar el mecanismo de transporte basándose únicamente en los datos obtenidos de la corriente aniónica.

Dependencia del voltaje del transporte de glutamato por EAAT4

Curiosamente, el transporte de glutamato por EAAT4 tiene una dependencia de voltaje única que no se ha observado anteriormente. EAAT muestra su máxima actividad de transporte cerca de 0 a -20 mV y se inactiva a potenciales de membrana más negativos. Este proceso de inactivación tiene lugar con una constante de tiempo en el rango de 15 ms después de un salto del potencial de membrana. La inactivación es más prominente en condiciones de transporte directo y se observa en menor medida en el modo de intercambio, lo que sugiere que los pasos en la rama del ciclo de transporte dependiente del potasio son lentos a voltajes muy negativos, lo que lleva a una captura de EAAT4 en los estados. que están asociados con la reubicación de potasio. Los estados asociados con el semiciclo dependiente de K + no son conductores de aniones. Por lo tanto, no solo el transporte, sino también la conductancia aniónica se inhibe a potenciales negativos. En el modo de intercambio, los estados asociados con el transporte de K + no son accesibles, como se mostró anteriormente para EAAC1 (Watzke et al., 2001). Por lo tanto, la inactivación de la corriente aniónica no es tan prominente en el modo de intercambio. Un modelo cinético simple que se muestra en el Esquema 1 describe muy bien los datos experimentales, como se muestra en las simulaciones numéricas (Fig. 10, A y B). El modelo predice que la inactivación a potenciales negativos está causada por la inhibición de la unión de potasio intracelular, la reubicación inducida por K + o la disociación de K + extracelular (agrupada en la transición T 'a T en el esquema 1). La valencia aparente asociada con la reacción respectiva se calculó como -1, teniendo un signo opuesto en comparación con las valencias aparentes de cualquier otra reacción parcial observada hasta ahora en los transportadores de glutamato. Por tanto, esta reacción se ralentiza con potenciales transmembrana cada vez más negativos, mientras que las reacciones asociadas con la unión de Na + y la translocación de glutamato se aceleran. Esta interpretación contrasta con informes anteriores sobre otros subtipos de transportadores de glutamato. En EAAC1, se propuso que la reacción de reubicación inducida por K + que limita la velocidad se acelera a potenciales negativos porque la carga positiva que se mueve hacia afuera durante el transporte de K + está sobrecompensada por las cargas negativas de los sitios de unión de cationes (Grewer et al., 2000 Grewer y Rauen, 2005). De acuerdo con este modelo, no se observa inactivación de corriente aniónica a potenciales negativos (ver Fig. 3 A y modelado en Fig. 10 A). Por lo tanto, la carga positiva movida hacia afuera durante el transporte de K + no se compensa con cargas negativas en EAAT4, o la unión de K + electrogénica desde el lado intracelular se vuelve limitante de la velocidad.

Una segunda observación interesante para EAAT4 es que la aparente afinidad por el glutamato depende del voltaje. La afinidad aumenta con voltajes cada vez más negativos (Fig. 4 E). Este comportamiento contrasta con EAAC1, que muestra una aparente afinidad por el glutamato independiente del voltaje, y también puede explicarse por el modelo de transporte simple que se muestra en el Esquema 1. Según este modelo, atrapamiento de glutamato por EAAT4 y regeneración del glutamato libre El sitio de unión tiene la dependencia de voltaje opuesta. Por lo tanto, los voltajes negativos conducen a una captura más eficiente del glutamato y, por lo tanto, a una mayor afinidad aparente. Este comportamiento también se puede cuantificar de acuerdo con las Ecs. 5A y 5B, como se muestra en la Fig.10 B. Sin embargo, la dependencia del voltaje del modelo Kmetro es ligeramente más empinada que la determinada experimentalmente. La razón puede ser que hay otras reacciones parciales en el mecanismo de transporte que afectan la dependencia del voltaje del transporte de EAAT4 que no se observaron aquí.

Cabe señalar que las valencias aparentes en el Esquema 1 se eligieron para dar como resultado un total de +2 cargas transportadas en un ciclo completo. Esto requiere que un H + y un tercer ión adicional de Na + se cotransporten con glutamato, iones que se despreciaron por simplicidad en el Esquema 1. Aunque no tenemos datos sobre la contribución de la unión y / o el movimiento transmembrana de estos dos iones a electrogenicidad del transportador, es posible que la electrogenicidad causada por su movimiento se agregue a la electrogenicidad de algunos pasos de reacción que se muestran en el Esquema 1. Por lo tanto, las valencias enumeradas en la Tabla I son valores aparentes y no son intrínsecos a los pasos de reacción individuales que se muestran en el Esquema 1, que contienen otras reacciones de unión a iones no mostradas.

Comparación con estudios previos que involucran EAAT4 expresada de forma nativa en neuronas cerebelosas

En dos informes anteriores se estudió la cinética del estado preestablecido de los transportadores expresados ​​de forma nativa en las células cerebelosas de Purkinje (Otis y Jahr, 1998 Auger y Attwell, 2000). En el primer informe, se investigó la cinética de la conductancia aniónica del transportador de glutamato expresado (Otis y Jahr, 1998). Estas cinéticas difieren significativamente de las del EAAT4 recombinante que se informa aquí. Primero, la tasa de aumento y disminución del componente de corriente transitoria es sustancialmente mayor que las tasas que se informan aquí. Por ejemplo, el componente transitorio de la corriente aniónica inducida por glutamato decayó en el transportador de células de Purkinje en & lt50 ms, mientras que la corriente transitoria de EAAT4 recombinante decae en 100 ms (Fig. 7 B). En segundo lugar, la relación entre la corriente transitoria y la corriente en estado estable es significativamente mayor en el informe de Otis y Jahr (Otis y Jahr, 1998) en comparación con nuestros resultados. En tercer lugar, el transportador de células de Purkinje tiene una aparente afinidad por el glutamato en el rango de 3 μM, mientras que encontramos valores en el rango submicromolar. En contraste, la cinética del transportador investigado en (Otis y Jahr, 1998) parece ser muy similar a las reportadas previamente por nosotros para EAAC1 expresado recombinantemente (Grewer et al., 2000), que también se expresa en neuronas cerebelosas de Purkinje ( Rothstein y col., 1994 Furuta y col., 1997). En el segundo informe, se estudió la cinética de la corriente aniónica activada por glutamato, así como la corriente de transporte (Auger y Attwell, 2000). Aunque una comparación directa de los resultados reportados por Auger et al. Para nuestros resultados es más difícil, porque los autores aplicaron glutamato al transportador solo durante un corto período de tiempo (1 ms), parece que ambos componentes de la corriente muestran una cinética más rápida que la cinética de la corriente EAAT4 que se informa aquí. De nuevo, estas cinéticas recuerdan más al EAAC1 expresado heterólogamente (Grewer et al., 2000 Watzke et al., 2001). Cabe señalar que hay otras dos posibles explicaciones para las diferentes cinéticas de EAAT4 recombinante y los transportadores nativos. (1) Las proteínas expresadas de forma nativa podrían modificarse diferencialmente postraduccionalmente en las neuronas en comparación con las del sistema celular HEK293 utilizado aquí. (2) Las concentraciones de glutamato utilizadas en los estudios anteriores fueron significativamente más altas (2 mM) que el máximo de ∼100 μM utilizado aquí. Sin embargo, dado que EAAT4 mostró un comportamiento de saturación a concentraciones & gt50 μM, es poco probable que el uso de [glutamato] más alto resulte en una cinética sustancialmente más rápida.

Importancia fisiológica

EAAT4 se expresa en niveles elevados en el cerebelo, específicamente en las células de Purkinje (Furuta et al., 1997). La expresión en las neuronas de Purkinje se dirige a las regiones de las espinas dendríticas, que están ligeramente alejadas de los contactos sinápticos excitadores (Dehnes et al., 1998) donde se libera el glutamato. Por lo tanto, es probable que el glutamato liberado presinápticamente entre primero en contacto con el transportador de baja afinidad y alta capacidad EAAT2, que se expresa en las células de la glía que rodean estrechamente las sinapsis de las fibras trepadoras (Bergles et al., 1997). Este sistema de baja afinidad elimina la mayor parte del glutamato liberado, pero no funciona eficazmente una vez que las concentraciones de glutamato alcanzan el nivel micromolar bajo. Especulamos que las moléculas de glutamato que escapan de la captación por los transportadores gliales y se difunden más lejos de los contactos sinápticos son eliminadas por el transportador neuronal de alta afinidad y baja capacidad EAAT4. Por tanto, la función principal de EAAT4 podría ser prevenir el desbordamiento a las sinapsis adyacentes y mantener la concentración de glutamato extracelular a un nivel submicromolar. Sin embargo, debido a su cinética lenta y su localización eliminada de la sinapsis, es poco probable que participe directamente en la terminación del proceso de transmisión sináptica, especialmente debido a la muy baja capacidad de absorción de glutamato de EAAT4.

Dado que se espera que EAAT4 funcione a concentraciones bajas de glutamato micromolar a submicromolar, se puede especular que el transportador no está optimizado para un funcionamiento rápido. A una concentración de 0,5 μM, EAAT4 se une solo a una molécula de glutamato cada 100 ms. Por lo tanto, la captura de glutamato por el transportador es muy probablemente el paso limitante de la velocidad y otras reacciones del transportador, como la translocación del glutamato, son comparativamente rápidas. Por el contrario, EAAT4 parece estar optimizado para la unión estrecha de glutamato. Varios factores contribuyen a esta optimización en comparación con los otros subtipos de transportadores: (a) los sitios de unión de Na + de mayor afinidad dan como resultado una mayor afinidad aparente por el glutamato (b) una disociación más lenta del glutamato conduce a una unión más estrecha (c) la dependencia del voltaje única del transporte da como resultado una mayor afinidad aparente por los potenciales fisiológicos transmembrana y, por tanto, una captura más eficaz del glutamato. Será interesante determinar la base molecular para esta optimización de alta afinidad de EAAT4.

Se espera que la captura más eficaz del glutamato por EAAT4 a potenciales transmembrana fisiológicos prolongue el estado de conducción de aniones de este subtipo de transportador de glutamato. La acción hiperpolarizante de EAAT4 podría contrarrestar la acción despolarizante de los transportadores de glutamato de “baja afinidad y alta capacidad”, como EAAT3. EAAT3 y EAAT4 se coexpresan en dendritas de células de Purkinje (Conti et al., 1998 Dehnes et al., 1998 Kugler y Schmitt, 1999), lo que sugiere una posible interacción cooperativa entre ambos subtipos de transportadores.


HDL: transporte inverso de colesterol

La función principal de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) es transportar el exceso de colesterol obtenido de los tejidos periféricos al hígado. La HDL también tiene otras funciones integrales en el transporte de lípidos, como el intercambio de proteínas y lípidos con quilomicrones y VLDL. Las partículas de HDL se pueden crear mediante varios mecanismos, sin embargo, las HDL nacientes se secretan principalmente en el hígado y el intestino como partículas relativamente pequeñas cuya capa, como la de otras lipoproteínas, contiene fosfolípidos, colesterol libre y una variedad de apoproteínas, específicamente apoAI, apoAII , apoCI y apoCII. Se encuentran niveles muy bajos de triacilgliceroles o ésteres de colesterol en el núcleo hueco de esta versión temprana o incipiente de HDL.

Figura 6.10: Interacción de quilomicrones y VLDL con HDL en circulación.

Las HDL también se pueden generar mediante la gemación de apoA a partir de quilomicrones y partículas de VLDL o de apoAI libre, que puede desprenderse de otras lipoproteínas circulantes. En este caso, la apoAI adquiere colesterol y fosfolípidos de otras lipoproteínas y membranas celulares, formando una partícula de HDL de aspecto naciente dentro de la circulación (Figura 6.10).


Resultados

Crecimiento y caracterización histológica de MCL

Se cultivaron capas multicelulares de células de adenocarcinoma de colon DLD1 en membranas de PTFE recubiertas de colágeno (Figura 1), que se hicieron flotar en matraces giratorios para proporcionar condiciones optimizadas para el crecimiento. Los MCL se utilizaron en el séptimo día de cultivo y mostraron una profundidad de tejido de 131 ± 10 μmetro. Se utilizó un ensayo basado en pimonidazol para detectar hipoxia en el MCL y demostrar la morfología del tejido (Figura 1D). La caracterización morfológica completa de este modelo de tejido se describió previamente (Modok et al, 2006). El MCL mostró tinción de pimonidazol hacia la superficie superior del tejido, lo que es indicativo de hipoxia. Esta hipoxia localizada puede explicarse por la alta demanda de oxígeno, que resulta de una población de células avasculares tan densamente empaquetada, similar a la de los esferoides tumorales. Esto sugiere que el modelo MCL es una buena representación de la arquitectura del tumor sólido y el microambiente asociado (Modok et al, 2006).

Difusividad y tasa de absorción celular de compuestos [14 C] -Pt (II) y [14 C] -Pt (IV) en MCL

El transporte de los compuestos a través de la membrana de PTFE con o sin MCL se midió cargando los fármacos marcados radiactivamente en la DC y midiendo la radiactividad que aparece en la RC a lo largo del tiempo (Figura 1A). Inicialmente, 150 y 1000 μSe cargaron l volúmenes de medio de cultivo en DC y RC respectivamente, para mantener un nivel de fluido equivalente y, por lo tanto, evitar el transporte convectivo impulsado por presión hidrostática. Se determinó la unión no específica de los compuestos a las superficies plásticas en DC y RC para mejorar la precisión de los análisis cuantitativos posteriores (Tabla 1). Por ejemplo, la fracción unida a la DC reduce el gradiente de concentración efectivo, mientras que la fracción unida a la RC reduce falsamente la tasa de flujo. Las fracciones unidas a las DC y a las RC se utilizaron para corregir la concentración inicial del fármaco y la concentración del fármaco transportado, respectivamente. La concentración acumulada de [14 C] -Pt (II) y [14 C] -Pt (IV) se expresó como un porcentaje de la concentración inicial de fármaco en las CD.

La Figura 2 muestra las cantidades acumulativas de complejos de Pt que aparecen en la DC del aparato MCL. Se proporcionan datos para los flujos en presencia o ausencia del tejido MCL superpuesto a la membrana de PTFE. Como era de esperar, la velocidad y la extensión del flujo fueron mayores para ambos fármacos en ausencia del MCL. Los datos de la Figura 2 demuestran claramente que no hubo diferencia entre [14 C] -Pt (IV) y [14 C] -Pt (II) con respecto a su apariencia acumulativa en las CD. El modelado matemático sin un parámetro de captación celular no se ajustaba a los datos obtenidos en presencia de un MCL, pero era una reflexión precisa para el paso a través de la membrana de PTFE sola. El modelo matemático que comprende un coeficiente de absorción se utilizó para cuantificar el flujo de los compuestos a través del modelo de tumor sólido y los datos se resumen en la Tabla 2. Los coeficientes de transferencia de masa (k) y porosidad relativa (ψ) los valores de los dos compuestos de platino a través de los MCL eran indistinguibles. El coeficiente de difusión se determinó para los fármacos Pt (IV) y Pt (II) mediante el modelo MCL utilizando los parámetros del coeficiente de transferencia de masa (k), Espesor de MCL (XMETRO), difusividad en el medio (D1) y concentración inicial del fármaco (CD). Los coeficientes de difusión calculados (DMETRO) y captación celular (gramo) las tasas no fueron diferentes para los dos compuestos de platino (Tabla 2), lo que refleja parámetros de flujo similares para las dos clases de complejo de platino en un tejido sólido.

Cinética de flujo de [14 C] -Pt (II) y [14 C] -Pt (IV) a través del MCL. Normalmente, concentraciones de 6 μ M [14 C] -Pt (II) (•) y 18 μ Se administraron M [14 C] -Pt (IV) (○) a las DC. La apariencia del compuesto radiomarcado en el CR se midió como se describe en Materiales y métodos. La concentración acumulada en el CR (CR) se dividió por la concentración inicial en la CD (CD) y se representa como la media ± desviación estándar. porcentaje de tres experimentos independientes. Las curvas se ajustaron utilizando los modelos matemáticos con (+) o sin (-) términos para la captación celular como se describe en los Materiales y Métodos. El flujo se midió a través de (A) la membrana PFTE solamente y (B) MCL crecido en la membrana PFTE.

Acumulación celular de [14 C] -Pt en el análisis MCL SRIXE

La acumulación de compuestos de Pt en el MCL se determinó midiendo la radiactividad retenida en la membrana de PTFE ± MCL después de los ensayos de transporte. Como se muestra en la Tabla 1, la radiactividad asociada con la membrana fue mayor en presencia del MCL, aunque no hubo diferencias significativas entre [14 C] -Pt (II) en comparación con [14 C] -Pt (IV). Los datos del modelo matemático anterior sugirieron un grado significativo de captación de fármacos Pt dentro del tejido MCL. Se utilizó el análisis de imágenes utilizando SRIXE para confirmar esta sugerencia y la técnica permitió un análisis elemental extenso del tejido MCL. Los datos muestran que el tejido que había estado expuesto al fármaco [14 C] -Pt (IV) se asoció con una señal de Pt incorporada (Figura 3). Esto confirmó los datos de modelos experimentales y matemáticos y demuestra que el flujo a través del tejido sólido está asociado con un grado no despreciable de captación del fármaco Pt en las células. La cuantificación de la señal de Pt a través del tejido reveló una mayor concentración de complejo de Pt (IV) en la superficie superior (es decir, frente a la DC) (Figura 4).

La acumulación celular de [14 C] -Pt (IV) en el análisis MCL: SRIXE. Después del ensayo de transporte, se procesó el MCL, se incrustó en cera y se 20 μSe obtuvieron imágenes de m secciones a través del MCL en un haz de rayos X de sincrotrón usando SRIXE. Se muestran imágenes ajustadas de las distribuciones elementales en segmentos de un MCL tratado con Pt (IV) y un MCL de control no tratado. La escala en los ejes representa el número de píxeles, donde cada píxel es 3 × 2 μm (horizontal x vertical). Las imágenes muestran concentraciones elementales relativas, utilizando la escala de colores mostrada, que va desde el azul, que representa niveles bajos, hasta el rojo, que representa niveles elementales altos. Las puntas de flecha indican la posición de la membrana de PTFE que soporta el MCL (que se muestra en la Figura 1D).

Cuantificación de la acumulación celular de [14 C] -Pt (IV) en MCL. Los contenidos de platino de las superficies expuestas a la DC y la RC se cuantificaron y normalizaron en relación con una región representativa de todo el MCL. Los valores se expresan como porcentajes, donde un valor de 100 indica un contenido elemental idéntico al de todo el MCL. Los datos representan la media y la e.s. asociado con dos exploraciones.

El efecto de la presión hidrostática sobre el flujo de [14 C] -Pt (IV) a través del MCL

Se ha propuesto que los compuestos de Pt (IV) de seis coordenadas muestran una mayor probabilidad de reducción de la especie Pt (II) activa en el microambiente intratumor hostil. En consecuencia, garantizar una penetración suficiente de los fármacos Pt (IV) en las capas más profundas de un tumor sigue siendo un tema clave. Una forma propuesta de mejorar la penetración es aumentar la presión hidrostática para contrarrestar el aumento de la presión intersticial generada en los tumores. El sistema MCL (Figura 1) proporciona un medio conveniente para investigar si la presión hidrostática puede modular el flujo de [14 C] -Pt (IV) a través del tejido tumoral sólido. La presión hidrostática se puede variar simplemente alterando los niveles de fluido en el DC y RC y se aplicó tanto en la misma dirección como en la opuesta al gradiente de concentración del sistema MCL. La Figura 5 muestra la cantidad acumulada de [14 C] -Pt (IV) que había penetrado a través del MCL hasta el RC inferior, en relación con la cantidad de fármaco añadida originalmente al DC. A una presión hidrostática de −3 mm H2O (es decir, contra el gradiente de concentración), la cantidad de penetración se redujo de 0,82 ± 0,01 a 0,73 ± 0,01%. Por el contrario, como la presión hidrostática se incrementó a +4 mm H2O (es decir, a lo largo del gradiente de concentración), el flujo de [14 C] -Pt (IV) aumentó a 1,06 ± 0,08%. Por tanto, los datos indican que incluso un gradiente de presión hidrostática relativamente menor fue capaz de tener una influencia significativa en el flujo de [14 C] -Pt (IV) a través del modelo de tumor MCL.

El efecto de la presión hidrostática sobre la cinética de flujo en MCL. Se aplicó presión hidrostática variando el volumen de medio añadido a la DC y la RC como se describe en Materiales y métodos. Se determinó la cinética de flujo [14 C] -Pt (IV) y la concentración de RC acumulada relativa a los valores de difusión únicamente se muestran como media ± s.e.m. de al menos tres experimentos independientes. * Diferencia estadísticamente significativa (PAG& lt0.05).


Cinética de transporte nuclear in vivo en Saccharomyces cerevisiae

Hemos descrito un ensayo de fluorescencia directa para medir las tasas relativas de importación y exportación pasiva dirigida por NLS de una proteína de fusión NLS-GFP en levadura. El diseño y construcción de la fusión del reportero GFP, sus cualidades espectrales, tamaño, uso de promotores inducibles y la elección de NLS, son variables que podrían extender la utilidad del método. Es casi seguro que las aplicaciones futuras exigirán la cuantificación de las velocidades de transporte en celdas individuales utilizando técnicas de análisis de imágenes. Como es el caso siempre que los procesos celulares se estudian in vivo, las propiedades de tráfico nuclear in vivo de NLS-GFP son complicadas y poco conocidas. Algunos se sentirán atraídos por los ensayos cinéticos de NLS-GFP simplemente porque se sabe muy poco sobre la función y la regulación del aparato de transporte en las células vivas. Al mismo tiempo, las incertidumbres que acompañan al trabajo in vivo impiden necesariamente la interpretación rigurosa de los datos, que los bioquímicos esperan de los experimentos realizados in vitro utilizando enzimas altamente purificadas.


Dos transportadores de fosfato de arroz, OsPht12 y OsPht16, tienen diferentes funciones y propiedades cinéticas en la captación y translocación.

Los transportadores de fosfato (Pi) de las plantas median la absorción y translocación de este nutriente dentro de las plantas. Un total de 13 secuencias en el genoma del arroz (Oryza sativa) pueden identificarse como pertenecientes a la familia del transportador Pi (Pht1). Aquí, informamos sobre los patrones de expresión, las propiedades biológicas y los roles fisiológicos de dos miembros de la familia: OsPht12 (OsPT2) y OsPht16 (OsPT6). La expresión de ambos genes aumentó significativamente bajo la privación de Pi en raíces y brotes. Mediante el uso de plantas de arroz transgénicas que expresan el gen informador GUS, impulsado por sus promotores, detectamos que OsPT2 se localizaba exclusivamente en la estela de las raíces primarias y laterales, mientras que OsPT6 se expresaba tanto en células epidérmicas como corticales de las raíces primarias y laterales más jóvenes. OsPT6, pero no OsPT2, pudo complementar un mutante de captación de Pi de levadura en el rango de concentración de alta afinidad. Los ovocitos de Xenopus inyectados con ARNm de OsPT2 mostraron un aumento de la acumulación de Pi y una despolarización del potencial eléctrico de la membrana celular provocada por Pi, cuando se les suministró concentraciones externas de mM. Ambos resultados muestran que OsPT2 mediaba la captación de Pi en los ovocitos. En el arroz transgénico, la eliminación de la expresión de OsPT2 o OsPT6 por la interferencia del ARN disminuyó significativamente tanto la absorción como el transporte a larga distancia de Pi desde las raíces hasta los brotes. En conjunto, estos datos sugieren que OsPT6 juega un papel amplio en la absorción y translocación de Pi en toda la planta, mientras que OsPT2 es un transportador de Pi de baja afinidad y funciona en la translocación del Pi almacenado en la planta.


Ver el vídeo: N5 Biology - Transport in Animals (Junio 2022).


Comentarios:

  1. Sagor

    Muy bien, eso bien llega a su fin.

  2. Feldun

    Esta variante no se acerca a mí. ¿Quizás todavía hay variantes?

  3. Jaroslav

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    no estas equivocado



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