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¿Los dos núcleos catalíticos de la ADN polimerasa III operan en la misma dirección?

¿Los dos núcleos catalíticos de la ADN polimerasa III operan en la misma dirección?


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Este diagrama es de Molecular Cell Biology de Lodish, 2000, que establece:

La otra molécula de polimerasa de núcleo, que alarga la hebra rezagada, se mueve con su pinza de subunidad β en la dirección opuesta a la del movimiento de la horquilla.

De nuevo, las imágenes proporcionadas en Principle of genetics de Simmons, 2015 y Cell Biology de Karp, indican que los núcleos catalíticos se dirigen en la misma dirección. El siguiente diagrama es del libro anterior.

¿Cuál es la correcta y por qué (proporcione citas)?


La holoenzima de la ADN polimerasa-III se mueve en una dirección (a lo largo de la bifurcación). Una de las ADN polimerasas funciona en la hebra rezagada, pero la enzima está orientada en la misma dirección que la que trabaja en la hebra principal. Para obtener más detalles, consulte esta revisión (es antigua, pero este hecho también es lo suficientemente antiguo).

El segundo diagrama que se muestra en su pregunta es una representación precisa de lo que sucede. Esta declaración es confusa (y engañosa):

La otra molécula de polimerasa de núcleo, que alarga la hebra rezagada, se mueve con su pinza de subunidad β en la dirección opuesta a la del movimiento de la horquilla.

Ambas polimerasas moverse en la misma dirección pero alargado ADN en direcciones opuestas. La dirección de alargamiento opuesta, como se muestra en la segunda figura, se facilita mediante el enrollamiento del cordón de revestimiento.

Simplemente puede buscar en Google "ADN polimerasa-III holoenzima" y obtendrá muchas fuentes que lo corroborarán.


Información sobre el replisoma a partir de la estructura de un complejo ternario de la subunidad α de la ADN polimerasa III

La estructura cristalina de la subunidad α catalítica de la holoenzima de la ADN polimerasa III (PolIIIα) unida al ADN cebador-molde y un desoxi-nucleósido 5′-trifosfato entrante se ha determinado con una resolución de 4,6 Å. La polimerasa interactúa con el esqueleto de azúcar-fosfato del ADN a través de su surco menor, lo que es posible gracias a los movimientos significativos del pulgar, el dedo y los dominios de unión β en relación con sus orientaciones en la estructura de la polimerasa no ligada. Además, el ADN y el nucleótido entrante se unen al sitio activo de PolIIIα de manera casi idéntica a como lo están en su complejo con la ADN polimerasa β, lo que demuestra que la polimerasa replicante eubacteriana, pero no la polimerasa replicante eucariota, es homóloga a la ADN polimerasa β. Finalmente, la superposición de una estructura reciente de la pinza unida al ADN en este complejo PolIIIα con ADN coloca un bucle del dominio de unión β en la hendidura de la pinza apropiada y apoya un mecanismo de cambio de polimerasa.


ADN polimerasa III, bacteriana ☆, ☆☆

Melissa L. Liriano,. Penny J. Beuning, en Módulo de referencia en ciencias biológicas, 2020

Replicación de ADN y síntesis de ADN concurrente de cadenas principales y rezagadas

In vitro La reconstitución del replisoma con pol III * purificada, clamp β, helicasa DnaB, primasa DnaG y SSB indica que un solo complejo pol III HE puede sintetizar simultáneamente las hebras principales y retrasadas en una bifurcación de replicación (Wu et al., 1992). Pol III HE es un complejo asimétrico funcional y estructuralmente con dos o tres polimerasas (Studwell-Vaughan y O'Donnell, 1991 McInerney et al., 2007), uno de los cuales participa en la síntesis de cadenas principales y el otro en la síntesis de cadenas rezagadas (Fig.1). La polimerasa de hebra principal sintetiza ADN de forma continua, pero la polimerasa de hebra rezagada se une y libera repetidamente del ADN para pasar de un fragmento de Okazaki al siguiente (McHenry, 2011b), aunque también hay evidencia del comportamiento dinámico de ambas polimerasas durante la replicación. (Graham et al., 2017 Xu y Dixon, 2018). Como la polimerasa de la hebra retrasada se mantiene en la bifurcación de replicación a través del puente de la subunidad τ y la polimerasa de la hebra principal, la reorientación de la polimerasa de la hebra retrasada al siguiente cebador es eficaz (Burgers y Kornberg, 1983). Se ha demostrado que la síntesis de la hebra retrasada es más rápida que la síntesis de la hebra principal para compensar estos procesos adicionales, que se facilitan a través de interacciones con SSB y la pinza β (Georgescu et al., 2014 ).

Pol III HE se carga inicialmente en el ADN cromosómico después de que se sintetiza el primer cebador de ARN dentro o cerca del origen de replicación (Kaguni, 2011). Una polimerasa unida al cebador de ARN inicial se convierte en la polimerasa de hebra principal, mientras que la otra polimerasa en el mismo complejo HE sirve como polimerasa de hebra retrasada. Una disposición asimétrica del complejo DnaX en pol III HE es la base de la asimetría funcional de la polimerasa replicativa (Dallmann et al., 1995 Johanson y McHenry, 1984). Se ha planteado la hipótesis de que la posición del complejo DnaX está sesgada hacia la polimerasa de hebra rezagada, que puede dirigir la carga de pinza a la hebra rezagada (Glover y McHenry, 2001).


Introducción

Las ADN polimerasas replicativas son responsables de duplicar el ADN cromosómico, que transporta una gran cantidad de información durante la división celular y, por lo tanto, debe replicarse con gran precisión para mantener la vida. Catalizan la adición de unidades de desoxinucleósido trifosfato (dNTP) a la columna vertebral del ADN en la replicación del ADN. La adición de los dNTP se produce directamente en la hebra de la plantilla de ADN, y la base del nuevo dNTP es complementaria a la base de la hebra de la plantilla. Dado que las bases se añaden al extremo 3 'de la hebra naciente, la reacción de polimerización debe proceder en la dirección 5' a 3 '. La estructura terciaria de la ADN polimerasa es tal que la enzima encaja sobre los pares de bases previamente formados. 1, 2 Estas bases deben emparejarse correctamente para que la polimerasa adopte su conformación funcional. 3-5

La ADN polimerasa III (pol III) es la ADN polimerasa replicativa en E. coli. 6-11 Es un dímero o trímero asimétrico que sintetiza las cadenas principales y tardías simultáneamente en la bifurcación de replicación. 6, 7, 12 Una helicasa desenrolla el ADN de doble hebra (dsDNA) en dos hebras molde anti-paralelas. Después de que la primasa sintetiza el cebador de ARN, el ADN pol III replica la cadena principal de forma continua y la cadena rezagada en los fragmentos de Okazaki en la dirección 5 'a 3'. 1, 6-8 Pol III se compone de 10 subunidades que coordinan la síntesis de la cadena principal y la rezagada. El núcleo de la polimerasa (núcleo pol III) contiene la subunidad α de la polimerasa, la exonucleasa de corrección de pruebas ε y una subunidad de función desconocida θ. 13, 14 El papel exacto de la subunidad θ aún está por determinar, pero su presencia aumenta la precisión de pol III y se ha sugerido para estabilizar la interacción entre α y ε. 15-17 Aunque el dímero es asimétrico 7, 18 para permitir la polimerización simultánea de ambas cadenas molde, el núcleo de cada rama consiste en el mismo complejo α ε θ. 13 La subunidad α de la polimerasa es una ADN polimerasa de la familia C, una familia que se encuentra solo en procariotas. 6 DNA pol III tiene una tasa catalítica extremadamente alta, a 103 bases / s, 13, 19 y alta fidelidad, con frecuencias de error de aproximadamente 10 −5 / bp sin corrección de pruebas 13, 20, 21 y 10 −8 / bp con corrección de pruebas . 13 En presencia de la pinza β, que une el ensamblaje de la proteína central a su sustrato de ADN, α exhibe una procesividad muy alta. 13, 22, 23

Durante la polimerización replicativa, se espera que exista una estrecha coordinación entre los ciclos de polimerización y exonucleólisis, para permitir una replicación eficiente y fiel. Se ha demostrado que las mutaciones que conducen a una pérdida de fidelidad durante E. coli replicación se encuentran en el dnaQ gen, que codifica la subunidad ε. 24-26 Sin embargo, el mecanismo molecular del cambio entre las subunidades de polimerasa y exonucleasa es poco conocido. Elucidar la estructura, función y actividad catalítica de estos motores moleculares es esencial para comprender los complejos mecanismos de replicación del ADN. Aquí, presentamos un enfoque de molécula única para manipular estas moléculas y caracterizar la dinámica de la polimerización y exonucleólisis del núcleo de pol III.

Observamos que la tensión mecánica aplicada al sustrato de ADN promueve el cambio entre las funciones de exonucleólisis y polimerización, lo que concuerda con estudios previos de una sola molécula sobre ADN polimerasas Fragmento de Klenow, T7 gp5 y ADN polimerasa φ29. 27-29 La dependencia de la fuerza de la velocidad de polimerización de T7 se modela como una función del cambio de energía libre involucrado en la conversión de ssDNA-dsDNA. 27 El esquema cinético propuesto para la ADN polimerasa de φ29 describe la transferencia del cebador intramolecular como consecuencia de un cambio conformacional en el ensamblaje de ADN de φ29 pol inducido por la tensión aplicada en la plantilla de ADN. 28 La diferencia clave entre el núcleo de pol III y estas polimerasas es que las actividades de edición y polimerización del núcleo de pol III se llevan a cabo mediante distintas subunidades, ε y α, respectivamente. Por tanto, la transferencia de cebadores entre los dominios catalíticos exo y pol se produce intermolecularmente. Además, la exoactividad de ε aislado es similar a la del núcleo de pol III y ε se considera una exonucleasa 3'-5 'altamente eficaz, capaz de funcionar independientemente de α. 30, 31 Se encuentra que la fuente de esta especificidad de edición exonucleolítica es la mayor capacidad de fusión de un terminal 3 'mal apareado tanto para el núcleo ε aislado como para el núcleo pol III. 32, 33 De acuerdo con ensayos bioquímicos a granel previos, la actividad exonucleasa de ambos núcleos ε y pol III es más eficiente con ssDNA. 32 Además, un esquema cinético de dos pasos para la reacción de exonucleasa de la subunidad ε aislada sugiere que el sustrato fisiológicamente relevante para la subunidad ε dentro del complejo de holoenzimas es ADNss de al menos tres nucleótidos de longitud. 33

Aquí, investigamos la dependencia de la fuerza de la polimerización y exonucleolisis del núcleo de pol III. Somos capaces por primera vez de caracterizar estos eventos catalíticos individuales en un solo sustrato de ADN de plantilla de cebador. Proponemos un esquema de reacción de dos estados para describir la tasa de iniciación exo inducida por la fuerza. Según nuestro modelo, el núcleo de pol III se une bimolecularmente en la unión cebador-plantilla y posteriormente se transforma en una conformación exo-activa que se ve fuertemente afectada por la fuerza de plantilla aplicada. Mostramos que este resultado está en concordancia cuantitativa con la dependencia de la temperatura de la exo-actividad previamente medida. Este análisis muestra que el cambio intermolecular del cebador entre las subunidades de polimerasa y exonucleasa es un proceso impulsado térmicamente que se rige por la desestabilización de la unión cebador-molde, haciéndolo más susceptible a la unión de exonucleasa.


Base molecular de la inhibición de PARP y oportunidades futuras en la terapia del cáncer de ovario

Polimerasa Poli (ADP-Ribosa)

El PARP se descubrió en 1962 e inicialmente se anticipó que facilitaría la protección y reparación de los tejidos. Sin embargo, no fue hasta la década de 1990 que su papel en la reparación del ADN comenzó a comprenderse y explotarse por completo. La familia PARP de proteínas poli (ADP-ribosyl) ating contiene 17 miembros [43]. Todos usan NAD + como sustrato para polimerizar el difosfato de adenosina para producir (ADP-ribosa)norte. PARP-1 es el miembro fundador de la familia más estudiado y probablemente el miembro más importante, pero generalmente los inhibidores de PARP carecen de especificidad enzimática. PARP-1 tiene un dominio de unión a ADN, un dominio de automodificación y un dominio catalítico de homología de PARP. Las PARP son proteínas nucleares con dominios de unión al ADN que localizan a la PARP en el sitio del daño del ADN y actúan como sensores de daño del ADN y moléculas de señalización para su reparación. La actividad de PARP es esencial para la reparación de rupturas de ADN monocatenario a través de NHEJ, BER y otros mecanismos. La eliminación de PARP-1 es suficiente para alterar significativamente la reparación del ADN después de la radiación o la agresión citotóxica. PARP-1 también participa en la inmunidad e inflamación innatas, las respuestas al estrés, el metabolismo celular y del organismo, la pluripotencia, la diferenciación y la señalización hormonal. Una mayor expresión de PARP en las células cancerosas conduce a una resistencia general a los fármacos.

PARP es parte del mecanismo de reparación del ADN, formando un andamio polimérico para otras enzimas importantes. Si este sistema se inhibe, la reparación del ADN no puede ocurrir si otros sistemas importantes de reparación del ADN se ven comprometidos, como cuando un paciente lleva un BRCA1 o 2 mutación.


Pregunta : 4) Responda las siguientes preguntas de opción múltiple: En la transcripción procariota, el papel del factor sigma es: A. catalizar la formación de enlaces fosfodiéster. B. colocar la ARN polimerasa en un sitio de inicio de la transcripción mediante la interacción con una caja de Pribnow. C. para liberar la transcripción completa del ADN molde. D. para proporcionar una lectura precisa

A. para catalizar la formación de enlaces fosfodiéster.

B. colocar la ARN polimerasa en un sitio de inicio de la transcripción mediante la interacción con una caja de Pribnow.

C. para liberar la transcripción completa del ADN molde.

D. para proporcionar una lectura precisa de los nucleótidos de la hebra molde de ADN

E. para terminar la transcripción en estructuras secundarias específicas.

F. más de uno de los anteriores.

A. ADN polimerasa I, ADN polimerasa III

B. ARN polimerasa II, ARN polimerasa III

C. ARN polimerasa I, ARN polimerasa III

D. ARN polimerasa alfa, ARN polimerasa delta

E. ARN polimerasa III, ARN polimerasa II

  1. La replicación del ADN se lleva a cabo en procariotas mediante la ADN polimerasa III. ¿Cuál de las siguientes afirmaciones resume correctamente las propiedades de la enzima?

A. se utiliza principalmente en la reparación del ADN para reemplazar nucleótidos dañados o alterados

B. no se puede degradar en una dirección de 3 'a 5'

C. no requiere una cadena de ácido nucleico preexistente para agregar (es decir, un cebador)

D. causa el crecimiento de la cadena al agregar pequeños trozos de ADN que contienen varios nucleótidos al extremo 3 'de una hebra existente

E. no se puede sintetizar en la dirección de 5 'a 3' y de 3 'a 5'

A. Tengo dos sitios catalíticos para la síntesis de ADN, mientras que III tiene uno.

B. I consta de múltiples subunidades polipeptídicas mientras que III consta de una sola subunidad.

C. Solo puedo sintetizar ADN, mientras que III solo puedo sintetizar ARN y ADN.


Métodos

Expresión y co-purificación de proteínas

Los DP1, DP2 y PolD de tipo salvaje de T. Kodakarensis se prepararon como se describió anteriormente [20]. DP1 y DP2CTD con etiqueta His (1000-1324) se produjeron en combinación con Escherichia coli Células BL21-CodonPlus (DE3) -RIL (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). mi. coli Las células se cultivaron a 37 ° C en medio Luria-Bertani, que contenía 50 μg / ml de ampicilina, 34 μg / ml de cloranfenicol y 50 μg / ml de kanamicina, hasta una DO600 = 0,3. La expresión génica se indujo añadiendo IPTG a una concentración final de 1 mM y las células se cultivaron a 25ºC durante 16 h. Las células se recogieron, se resuspendieron en tampón A, que contenía HEPES 20 mM, pH 7,5, NaCl 1 M e imidazol 10 mM, y se rompieron mediante sonicación, seguido de tratamiento térmico a 80ºC durante 20 min. La fracción soluble se aplicó a la columna de afinidad llena con resina TALON (Takara Bio, Shiga, Japón), y la columna se lavó con tampón A. La fracción unida se eluyó con HEPES 20 mM, pH 7,5, NaCl 1 M y 150 imidazol mM. El procedimiento de purificación adicional se describió anteriormente con algunas modificaciones [20]. PolDΔPIP (DP2Δ1314-1324), PolDΔKR (DP1 K326A / R328A y DP2 K432A / R434A / R781A) y PolDΔPIPΔKR se prepararon mediante el recombinante mi. coli, que contiene los genes correspondientes, en los que cada mutación se introdujo mediante mutagénesis dirigida al sitio mediada por PCR. Cada mutación diseñada se confirmó mediante secuenciación de nucleótidos. Los cebadores utilizados para cada mutagénesis son los siguientes: TK1903_R781A_F 5 'GCCCGCCGACCTGTTAGCGCAGGCCATGGACAACC-3', TK1903_ R781A_R 5 'GGTTGTCCATGGCCTGCGCTAACAGGTCGGCGGGC-3', 5 'TK1903_K432R434A_F-GACTATGAAACGGCTCTAGCGGTCGCGAACGAGGTTGACGAGATC-3', 5 'TK1903_K432R434A_R-GATCTCGTCAACCTCGTTCGCGACCGCTAGAGCCGTTTCATAGTC-3', TK1902_K326R328A_F 5 ' -GAAGTTCGAGGTTCCCGCGGTCGCGAACGCCCAGAGCAAGG-3 ′, TK1902_K326R328A_R 5′-CCTTGCTCTGGGCGTTCGCGACCGCGGGAACCTCGAACTTC-3 ′.

Para las purificaciones de estos PolD, se utilizaron TOYOPEAL Phenyl 650S (TOSOH, Tokio, Japón), HiTrap Heparin HP (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido) y BioPro IEX SmartSep Q10 (YMC) para la cromatografía en columna. T. Kodakarensis tiene dos PCNA, PCNA1 y PCNA2, y PCNA1 es la molécula de sujeción esencial en las células [23]. Por lo tanto, PCNA1 se denomina TkoPCNA en este estudio. La purificación de TkoPCNA se realizó como se describió anteriormente [23].

Preparación del complejo PolD-PCNA-DNA

Reconstituimos el complejo PolD-PCNA-DNA mezclando las proteínas TkoPolD y TkoPCNA purificadas, con dos tipos de ADN cebado, que se prepararon recociendo dos desoxioligonucleótidos que se muestran en el archivo adicional: Figura S1 (sintetizada por Hokkaido System Science, Hokkaido, Japón y Sigma-Aldrich Japón, Tokio, Japón) en Bis-Tris 20 mM, pH 7,0 y NaCl 50 mM, y se incubó a 37 ° C durante 15 min. Para evitar la degradación de los ADN cebados por la exonucleasa 3'-5 'de PolD, se introdujeron cuatro modificaciones sucesivas de fosforotioato en el extremo 3' de ambas cadenas. El TkoPolD purificado, el TkoPCNA y el ADN cebado (30/45) (las secuencias se muestran en el archivo adicional: Figura S1) se mezclaron y se incubaron en una solución que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 300 mM, 1 mM Ditiotreitol, EDTA 0,1 mM (sin MgCl2) a 20 ° C durante 15 min. El complejo PolD-PCNA-ADN (30/45) reconstituido se cargó en una columna de filtración en gel Superdex 200 5/150 (GE Healthcare) equilibrada con una solución de la misma composición, que contenía NaCl a 50 mM en lugar de 300 mM. Para la preparación del complejo PolD-PCNA-DNA (25/35), la mezcla se cargó en la misma columna, pero el tampón de equilibrio y elución contenía NaCl 150 mM, en lugar de 50 mM. Las composiciones de proteínas de ambos complejos, eluidas en las fracciones máximas, se analizaron mediante SDS-PAGE.

Microscopía electrónica y análisis de imágenes de una sola partícula

Para la muestra teñida negativamente, se aplicó una alícuota de 3 μl de solución de muestra a una película de carbón delgada continua con descarga luminiscente sostenida por una rejilla de cobre, se dejó durante 1 min y luego se tiñó con tres gotas de 2 % acetato de uranilo. Las muestras teñidas se examinan con un microscopio electrónico Tecnai T20 (FEI, Hillsboro, OR) operado a un voltaje de aceleración de 200 kV. Las imágenes se grabaron utilizando una cámara CCD Eagle 2k (FEI). Se utilizaron rejillas de carbón perforado (Quantifoil R1.2 / 1.3 Au 200) para las muestras hidratadas congeladas. Las rejillas se descargaron con brillo durante 1 minuto mediante un dispositivo de tratamiento hidrófilo HDT-400 (JEOL, Tokio, Japón) antes de su uso. Se aplicaron dos o tres μl de soluciones de muestra en rejillas perforadas para una congelación rápida. La congelación rápida se realizó utilizando robots de congelación EM-GP (Leica Wetzlar, Alemania) o Vitrobot (FEI).

Recopilación de datos Cryo-EM

Todas las muestras hidratadas congeladas se examinaron primero mediante un microscopio electrónico Polara (FEI) operado a un voltaje de aceleración de 200 kV, para optimizar las condiciones de preparación de la muestra. Las imágenes se tomaron utilizando una cámara CCD UltraScan 2 k con un filtro de energía Gatan GIF Tridiem (GATAN, Pleasaston, CA) o una cámara CCD UltraScan 4 k (GATAN). Se recolectaron conjuntos de datos de imágenes de microscopía electrónica del complejo PolD-PCNA-DNA (30/45) para análisis de estructura en un microscopio electrónico Titan Krios (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), equipado con un corrector de aberración esférica (Cs) (CEOS GmbH, Heidelberg, Alemania), bajo voltaje de aceleración de 300 kV. Se utilizó un software EPU (Thermo Fisher Scientific) para la recopilación de datos totalmente automatizada. Las imágenes se registraron con el detector de electrones directo Falcon II (Thermo Fisher Scientific), en el modo de fraccionamiento de dosis (exposición de 2 s / 32 fracciones), con un aumento nominal de × 59.000, correspondiente a 1,10 Å / píxel en la muestra. El desenfoque nominal estuvo en el rango de - 1.0 μm

- 1,4 μm. Se utilizó una dosis total de electrones de 36 electrones / Å 2 para cada registro de imagen. Se utilizó una placa de fase Volta (VPP) para mejorar el contraste de las imágenes de partículas. Se recogieron imágenes de microscopio electrónico del complejo PolD-PCNA-DNA (25/35) para el análisis de la estructura en un microscopio electrónico Talos Arctica (Thermo Fisher Scientific) utilizando un detector de electrones directo Falcon 3EC (Thermo Fisher Scientific). Las imágenes se registraron en el modo de conteo de electrones, con un aumento nominal de × 92.000, correspondiente a 1,12 Å / píxel en la muestra, con un tiempo de exposición total de 47 s. El rango de desenfoque nominal de los datos fue - 1.0 μm

- 3,0 μm. Los fotogramas intermedios (1821 películas en total) se grabaron cada 0,64 s, dando una dosis acumulada de 40 electrones / Å 2 y un total de 74 fracciones por imagen (es decir, 0,54 electrones / Å 2 dosis por fracción).

Procesamiento de imágenes Cryo-EM

Se alinearon fotogramas de película de PolD-PCNA-DNA (25/35) y PolD-PCNA-DNA (30/45) para corregir los movimientos inducidos por dosis y ponderados por dosis de las muestras utilizando MotionCor2 [43]. La función de transferencia de contraste se determinó para cada imagen utilizando el programa CTFFIND4 [44]. Aproximadamente mil imágenes de partículas se tomaron manualmente de las imágenes utilizando las herramientas de recolección manual de Relion [45]. Este pequeño conjunto de datos inicial se sometió a una clasificación 2D sin referencia en Relion. Se utilizaron imágenes medias de clase "buenas" seleccionadas como referencias para recoger partículas automáticamente, utilizando Gautomatch (http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/). Las coordenadas de salida de las partículas recogidas se utilizaron para el programa de extracción de partículas de Relion [45].

Se extrajeron un total de 240.256 partículas de las imágenes del complejo PolD-PCNA-DNA (30/45) y, después del procedimiento de clasificación 2D, las partículas clasificadas como "malas" se eliminaron del conjunto de datos. En total, 171,739 partículas fueron sometidas al procedimiento de clasificación 3D en Relion (Class3D), asumiendo ocho clases. Las partículas clasificadas como las mejores (clase 8, 30.889 partículas) y las segundas mejores (clase 1, 19.356 partículas) clases 3D se utilizaron además para refinar (Refine3D en RELION) cada una de las dos clases de mapas 3D. El mapa refinado de clase 1 (correspondiente a la Forma B), se agudizó aplicando un factor B negativo (- 150) y se corrigió para el MTF del detector Falcon II.

Las 309,113 imágenes extraídas del complejo PolD-PCNA-DNA (25/35) se sometieron a 2 turnos de clasificación 2D sin referencia (Clase 2D, Relion) y al procedimiento de selección de partículas para eliminar las malas imágenes. En total, 230.965 imágenes del complejo PolD-PCNA-DNA (25/35) se sometieron al procedimiento de clasificación 3D en Relion asumiendo ocho clases de estructuras 3D. El volumen inicial para este procedimiento se obtuvo mediante el procedimiento de “modelo inicial 3D” en Relion. Entre las ocho clases, solo una clase 3D (Clase 2) correspondiente a la Forma A, exhibió una estructura interpretable de alta resolución. Además, 41.073 imágenes de partículas, asignadas a esta clase, se utilizaron para el "refinamiento automático 3D" en Relion. Después del refinamiento, se aplicaron "Refinamiento de película" y "Pulido de partículas" para mejorar la resolución. El mapa final se obtuvo después del segundo "Auto refinamiento 3D" y "Post Proceso" que incluye el enmascaramiento 3D, la corrección para el MTF del detector Falcon 3EC y el afilado del factor B (B = - 500). La resolución de los mapas finales fue estimada por el estándar de oro FSC utilizando los criterios FSC = 0.143.

Construcción del modelo TkoPolD-PCNA-DNA

Las coordenadas del modelo del complejo TkoPolD-PCNA-ADN se construyeron ensamblando varias estructuras cristalinas y aplicando el método de modelado de homología. Las estructuras cristalinas de PAG. abyssi DP1 (PDB: 5IHE) y DP2 (PDB: 5IJL) [17] se ajustaron primero en el mapa de densidad de la Forma A como se describe en el texto. Luego, la estructura cristalina del trímero de TkoPCNA (PDB: 3LX1) y un modelo de ADN cebado (30/45) en parámetros estándar de forma B se ajustaron al mapa de densidad [46].

A continuación, se construyeron las partes del modelo, que no se presentaron en los homólogos cercanos mencionados anteriormente. En la interfaz DP1-DP2 se observó una densidad que se predice que es un haz de hélice, que se presume que es similar a la de la subunidad polα B-subunidad catalítica de Polα humana (PDB: 4Y97) o la subunidad 2 de Polε humana-subunidad A catalítica (PDB : 5VBN) interfaces [33, 34]. Por tanto, Phe1322-Phe1440 de la subunidad catalítica Polα (cadena B de 4Y97) se introdujo en el modelo superponiendo la subunidad α de la ADN polimerasa B (cadena A de 4Y97) en la subunidad DP1. Se observó una densidad que se predijo que sería una hélice corta en el sitio de unión a PIP de PCNA. TkoDP2 tenía péptido PIP-box (1316-ISLDEFFGS-1324) en el extremo C-terminal, que era similar al de la subunidad B de la ARNasa H2 humana (295-KSIDTFF-301 cadena B de PDB: 3P87) o helicasa de hibridación de ADN y endonucleasa ZRANB3 (518-KQHDIRSFFV-527 cadena B de PDB: 5MLO), en el que los residuos consecutivos de Phe proporcionaron la mayoría de las interacciones con el PCNA [47, 48]. Por tanto, el péptido PIP-box (cadena B de 3P87) se introdujo en el modelo superponiendo PCNA (cadena A de 3P87 sobre la cadena E de la T. Kodakarensis modelo).

Luego, las secuencias de las partes modeladas se convirtieron en la de T. Kodakarensis subunidades mediante modelos de homología utilizando MODELLER [49]. Las coordenadas del modelo se refinaron aún más usando PHENIX suite [50], aplicando repetidamente refinamiento del espacio real usando phenix.real_space_refine [51], refinamiento manual del modelo usando COOT [52] y optimización de geometría usando phenix.geometry_minimization. Los residuos ausentes del modelo original y que forman principalmente hélices se agregaron al modelo donde eran consecutivos a las partes modeladas si se observaban densidades significativas. Fueron consistentes con las predicciones de la estructura secundaria, a saber, Asn319 – Val327 de DP1 e Ile331 – Pro346, Val454 – Asn457, Arg1007 – Val1018, Gly1080 – His1103 y Thr1282 – Arg1294 de DP2. El modelo finalmente mostró un coeficiente de correlación de mapa de 0,76 para la celda unitaria completa (0,70 para la región enmascarada), y la puntuación MolProbity de 1,87, con 0% de valor atípico de Ramachandran, 0,15% de valor atípico de rotámero y 16,03 de puntuación de choque [53]. Los segmentos sin modelar en el modelo final fueron el dominio N-terminal (Met1-Ala285) de DP1, y Lys289-Asn314, Arg365-Thr371, Asp383-Lys399, Ala663-Met676, Arg1048-Leu1079, Glu1199-Leu1281 y Gly1295-Lys1314 de DP2. El modelo de la Forma B se construyó sobre la base del modelo de la Forma A aplicando refinamiento del espacio real, refinamiento manual y optimización de la geometría como para el modelo de la Forma A. El modelo final mostró un coeficiente de correlación de mapa de 0,87 para la celda unitaria completa (0,78 para la región enmascarada) y la puntuación MolProbity de 1,63, con 0% de valor atípico de Ramachandran, 0,35% de valor atípico de rotámero y 11,73 puntuación de choque (Archivo adicional: Tabla S1) . Las coordenadas de los modelos Forma A y Forma B se han depositado en el Protein Data Bank con los códigos de acceso 6KNB y 6KNC, respectivamente.

Ensayo de levadura de dos híbridos

Se usó un sistema de detección de levadura de dos híbridos (Y2H) (Matchmaker ™ Gold Yeast Two-hybrid System, Matchmaker GAL4 Two-Hybrid System 3, Takara Bio) para detectar la región de interacción DP1-DP2. El plásmido pGBKT7, que codifica la región de unión al ADN de GAL4, y el plásmido pGADT7, que codifica los dominios de activación, se utilizaron, respectivamente, para preparar plásmidos que contienen el gen que codifica DP1 y varios fragmentos de DP2. Las cotransformaciones de las células de levadura Y2H Gold con pGBKT7-DP1 y los fragmentos pGADT7-DP2 se realizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante (manual Clontech Matchmaker). Se colocaron suspensiones de células (3 μl de 2 × 10 6 células / ml) de cada cepa en placas sintéticas definidas (SD) sin Leu y Trp para placa de no selección y Leu, Trp e His, o Leu, Trip, His, y Ade para dos placas de fuerza de selección diferentes. Las placas de agar se incubaron a 30 ° C durante 4 días y las células en crecimiento indicaron las interacciones de las dos proteínas producidas a partir de los dos plásmidos utilizados para la cotransformación.

Ensayo de extensión del cebador

La capacidad de extensión del cebador de TkoPolD se midió contando la radiactividad incorporada en las cadenas de ADN utilizando dNTP que contiene [metil-3 H] -dTTP como sustratos, y las actividades se compararon entre WT, ΔPIP, ΔKR y ΔPIPΔKR en presencia y ausencia de PCNA. La reacción se realizó en 25 μl que contenían Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, KCl 10 mM, (NH4)2ASI QUE4, MgCl 2 mM2, Triton X-100 al 0,1% y 0,1 mg / ml de BSA, sustrato de cebador de plantilla 10 nM (preparado mediante hibridación de M13mp18ssDNA y un desoxioligonucleótido, M13-63 5′-dTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGA3, incluido metil 3′ATCCGGGTACCGAGCTCGA3 H] -dTTP (PerkinElmer, MA), PCNA 20 nM y PolD 5 nM, a 72ºC durante 1, 2 y 4 min. La mezcla de reacción se preincubó durante 3 min y se añadió PolD para iniciar la reacción. Después de la incubación, se fraccionaron alícuotas (8 µl) y se colocaron en filtros DE81 (GE Healthcare). Los filtros se lavaron con Na al 5%.2HPO4 solución tres veces y se seca. La radiactividad incorporada se midió con un contador de centelleo Tri-Carb 3110TR (PerkinElmer).

Ensayo de actividad exonucleasa 3′-5 ′

La reacción de exonucleasa se realizó en un 20 μl que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8.0, KCl 10 mM, (NH4)2ASI QUE4, DTT 1 mM, BSA 0,1 mg / ml, MgCl 2 mM2, y sustratos de ADN marcados con Cy5 de 10 nM (preparados por hibridación de dos desoxioligonucleótidos, 5 ′ Cy5 pri32 y temp45, que se muestran en el archivo adicional: Figura S1, y 50 nM de las proteínas recombinantes a 65 ° C durante los tiempos indicados). La mezcla de reacción se preincubó durante 2 min y se añadieron las proteínas para iniciar la reacción. Después de la incubación, se fraccionó una alícuota (4 µl) y se añadió un volumen igual de solución de parada (formamida al 98% y G naranja al 0,01%) seguido de urea 8 M-PAGE al 15%. Las imágenes de gel se visualizaron usando un generador de imágenes Typhoon Trio + (GE Healthcare).

Ensayo de cambio de movilidad electroforética

El ensayo de cambio de movilidad electroforética se realizó en 20 μl que contenían Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, KCl 10 mM, 10 mM (NH4)2ASI QUE4, DTT 1 mM, BSA 0,1 mg / ml, MgCl 2 mM2, 2, 5 nM de ADN etiquetado con Cy5 (5 ′ Cy5 pri32 para ssDNA, 5 ′ Cy5 pri32 y temp45 para ADN cebado, que se muestra en el archivo adicional: Figura S1) sustratos y concentraciones indicadas de proteínas a 40 ° C durante 10 min . Los complejos de proteína-ADN se fraccionaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8% en tampón TAE 0,1 × y se visualizaron con un generador de imágenes Typhoon Trio +. Las afinidades de unión se calcularon como se describió anteriormente [54].

Análisis de resonancia de plasmón superficial (SPR)

Se utilizó el sistema Biacore J (GE Healthcare) para probar las interacciones físicas de PCNA con varios mutantes de PolD. PCNA se fijó en un chip sensor CM5 (GE Healthcare), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Para medir los parámetros cinéticos, PolDs purificados (PolDwt, PolDΔPIP, PolDΔKR y PolDΔPIPΔKR) en un tampón de ejecución (HEPES-NaOH 10 mM pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.1% Tween 20), con seis concentraciones diferentes (50, 100, 200, 300, 500, 1000 nM), se aplicaron durante 120 s al chip inmovilizado con PCNA, a un caudal continuo de 30 μl / min a 25 ° C. Los analitos unidos se eliminaron lavándolos con tampón de regeneración (HEPES-NaOH 10 mM, pH 7,4, NaCl 1 M, Tween 20 al 0,1%) al final de cada ciclo. Las constantes de equilibrio aparente (KD) of the interactions were determined from the association and dissociation curves of the sensorgrams, using the BIAevaluation (ver. 4.1) software (GE Healthcare).

Analytical gel filtration chromatography

Analytical gel filtration chromatography was performed using the SMART system (Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, UK). PolD (wt, ΔPIP, ΔKR, ΔPIPΔKR), PCNA, and DNA (each 5.4 μM, as a heterodimer: PolD, homotrimer: PCNA in 30 μl) were mixed and incubated for 3 min at 60 °C. The protein solutions were applied to a Superose 6 PC 3.2/30 column (GE Healthcare) and were eluted with buffer containing 50 mM Tris–HCl, pH 8.0, and 0.3 M NaCl. Aliquots (5 μl) of applied solution and aliquots (8 μl) of each fraction from the eluates were subjected to 10% SDS-PAGE, followed by Coomassie Brilliant Blue staining. The standard marker proteins, including thyroglobulin (670,000), γ-globulin (158,000), ovalbumin (44,000), and myoglobin (17,000), were also subjected to gel filtration as controls.


DNA Polymerase ε: A Polymerase of Unusual Size (and Complexity)

DNA polymerase epsilon (Pol epsilon) is a large, multi-subunit polymerase that is conserved throughout all eukaryotes. In addition to its role as one of the three DNA polymerases responsible for bulk chromosomal replication, Pol epsilon is implicated in a wide variety of important cellular processes, including the repair of damaged DNA, DNA recombination, and the regulation of proper cell cycle progression. Pol ε catalyzes DNA template-dependent DNA synthesis by a phosphoryl transfer reaction involving nucleophilic attack by the 30 hydroxyl of the primer terminus on the a-phosphate of the incoming deoxynucleoside triphosphate (dNTP). The products of this reaction are pyrophosphate and a DNA chain increased in length by one nucleotide. The catalytic mechanism is conserved among DNA polymerases. It begins with binding of a primer template to the polymerase. Like all polymerases, Pol ε ultimately does not generate all types of errors at equal rates, but rather has distinctive error specificity. Two features of Pol ε error specificity are particularly interesting in light of its proposed biological roles in DNA replication. One is that Pol ε is among the most accurate of DNA polymerases for single base deletion/insertion errors. Because indels are typically generated more frequently within repetitive sequences, this property may be relevant to the proposal that Pol ε has a particularly important role in replicating heterochromatic DNA, which is enriched in repetitive sequences. Another is that a mutant derivative of Pol ε has a unique base substitution error specificity that has been useful for inferring its role in replication of the leading strand template.


Fondo

The DNA polymerases at the core of every bacterial replisome belong to the C-family of DNA polymerases [1]. All members of this family contain a set of four domains that are organised within a single polypeptide in the following order: Polymerase and Histidinol Phosphatase (PHP), Palm, Thumb and Fingers. While these four domains always appear in the same order, the DNA polymerase III (Pol III) and DNA polymerase C (Pol C) subfamilies can be distinguished within the C-family of DNA polymerases, depending on the arrangement of additional accessory domains, such as the OB-fold domain that binds single-stranded DNA [2–4]. Neither Pol III nor Pol C share detectable sequence homology with other DNA polymerases, including bacterial DNA polymerases such as Pol I and Pol II and the eukaryotic replicative DNA polymerases ϵ and δ.

The crystal structures of Escherichia coli (E. coli) Pol III [5], Thermus aquaticus (T. aquaticus) Pol III [6] and Geobacillus kaustophilus (G. kaustophilus) Pol C [7] have shown that the active sites of these polymerases are structurally related to that of human DNA polymerase β, an atypical DNA polymerase that is involved in base excision repair and belongs to the X-family of DNA polymerases. This is surprising, as X-family polymerases are typically slow and exhibit low fidelity and processivity, in contrast to the high-fidelity replicative C-family polymerases, which are amongst the fastest polymerases known.

Pol III and Pol C polymerases are also unique in that they contain a Polymerase and Histidinol Phosphatase (PHP) domain that is not found in other polymerases, except for some bacterial Pol X family members [8]. The PHP domain in Pol III and Pol C is a barrel-shaped domain located at the side of the polymerase, near the Thumb domain [5, 6]. The active site of typical PHP domains is a shallow cavity located at the top of the barrel-shaped domain, usually consisting of seven β-strands that provide most of the residues that coordinate the catalytic metals. Several crystal structures of PHP domains have been determined. These include PHP domains that are not part of a larger protein: E. coli YcdX [9], Thermus thermophilus (T. thermophilus) histidinol phosphate phosphatase (ppPHP) [10] and tm0559 from Thermatoga maritima (T. maritima) (pdb code 2ANU) or those that are part of polymerases: E. coli Pol III [5], T. aquaticus Pol III [6], G. kaustophilus Pol C [7] and Deinococcus radiodurans (D. radiodurans) Pol X [11].

The role of the PHP domain in Pol III and Pol C polymerases remains unclear. When first identified in sequence alignments, the PHP domain in Pol III/Pol C was hypothesized to act as a pyrophosphatase, removing the by-product of DNA synthesis in order to drive the polymerization reaction in the direction of DNA synthesis [8]. However, no such activity has been detected as yet for a polymerase PHP domain. Instead, the PHP domains of T. thermophilus Pol III and T. aquaticus Pol III, which have a complete set of metal-coordinating residues and have been shown to bind metals, have exonuclease activity [12, 13], which presumably serves to proofread newly synthesized DNA. Likewise, the PHP domains of Pol X from both Bacillus subtilis (B. subtilis) [14] and T. thermophilus [15] have exonuclease activity. In contrast, no exonuclease activity could be detected for the PHP domain of G. kaustophilus Pol C [7].

The invariable presence of the PHP domain in all C-family polymerases, even those lacking exonuclease activity, suggests that this domain must play an essential, yet non-enzymatic, role in maintaining the activities of these polymerases. We show, using sequence analysis, that the loss of metal-coordinating residues in the Pol III PHP domain is correlated with the presence in bacterial genomes of a protein homologous to the E. coli Pol III proofreading exonuclease ϵ subunit. Despite the apparent loss of catalytic function, the structural scaffold of the PHP domain has been conserved to a remarkable degree. This observation is strongly supported by our ability to restore metal binding to the E. coli Pol III PHP domain by introducing only three point mutations. We further show that the structural integrity of the PHP domain is important for the stability and activity of the E. coli Pol III.


Métodos

Protein and DNA preparation

The catalytic core of human p180 (residues 338–1259) harboring a N-terminal hexahistidine SUMO (His6-SMT) tag was expressed in the E. coli BL21 (DE3) Star pLysS strain. Protein was purified by affinity chromatography with His60 Ni Superflow Cartridge. The His6-SMT was removed via overnight incubation with SUMO protease, and the protein was subsequently purified via ion-exchange (HiTrap Q column) and size-exclusion (Superdex 200) chromatography. Purified protein was concentrated and stored at −80 °C until further use.

The primer and template strands used for crystallization were purified by anion exchange on a MonoQ column, desalted and lyophilized before crystallization. Purified 13-nt primer harboring a dideoxycytosine at the 3′ end (ATCCTTCCCCTACdd) was mixed with purified 18-nt template (TAATGGTAGGGGAAGGAT) in 1:1 ratio and annealed to yield a 13/18 template-primer duplex DNA with one replicative end.

Cocrystallization

The p180 (core) ternary complex was prepared by mixing purified hPolα (388–1259) and the 13/18 template – primer DNA duplex in the ratio of 1:1, followed by the addition of dCTP and MgCl2 to final concentrations of 5 and 10 mM respectively. Crystals were obtained in a solution containing 10% polyethylene glycol 4000, 0.2 M sodium citrate, 10% isopropanol, 0.1 M sodium citrate buffer (pH = 5.5). For data collection, crystals were cryoprotected by gradually replacing the mother liquor in the drop for a new one containing 20% glycerol and then flash frozen in liquid nitrogen. X-ray data on cryocooled crystals were measured at the National Synchrotron Light Source (NSLS, beamline X25) of Brookhaven National Laboratory at a wavelength of 1.1 Å. Data sets were indexed and integrated using iMOSFLM 25 . Crystals diffract to 3.3 Å and belong to space group P1 21 1 with unit cell dimensions of a = 137.04 Å, b = 132.03 Å, c = 163.14 Å and α = 90° β = 109.13°, γ = 90°. Matthew’s coefficient suggested four protein-DNA molecules in the asymmetric unit (based on 59% solvent by volume).

Structure determination and refinement

The structure of p180 was solved by molecular replacement (MR), using the program Mr. Bump 26 . The software was able to find a solution using as a search model the structure of the ternary complex of the yeast homolog 9 . The first round of rigid body refinement and map calculation was carried out without the template/primer/dNTP using the program PHENIX 27 . The electron density maps (2Fo-Fc and Fo-Fc) showed unambiguous densities for the template and primer DNA strands, which were then included in the model for subsequent refinement. Standard individual xyz refinement was used with individual B factors along with TLS refinement (32 groups). During the first rounds of refinement torsion-angle non-crystallographic symmetry (NCS) restraints were used. The NCS restraints were removed during the later stages of refinement to avoid missing local differences in the 4 molecules of the asymmetric unit. Weight optimization of the geometry and B-factor restraints were carried out towards the end of refinement to prevent over fitting. The iterative rounds of refinement and water picking were performed with PHENIX and model building with program Coot 28 . The final refined model (Rfree of 22.9% Rwork of 18.3%) contains four protein chains (A, residues 338–673, 680–808, 836–881, 898–1245 D, residues 338–674, 679–807, 837–881, 896–1255 G, residues 338–675, 678–808, 838–881, 895–1244 J, residues 338–673, 679–808, 836–881, 897–1245), eight DNA strands (B (template), residues 3–18 C (primer), 1–13 E (template), residues 2–18 F (primer), 1–13 H (template), residues 2–15 I (primer), 4–13 K (template), residues 3–18 L (primer), 1–13), and 100 solvent molecules. The model has good stereochemistry as shown by MolProbity 29 with >95.6% of all residues in allowed regions of the Ramachandran plot and less than 0.1% in the disallowed regions. Coordinates have been deposited in the Protein Data Bank with the accession code 5IUD. Figures were prepared using PyMol (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.7.4.4, Schrödinger, LLC).

Structural analysis

Protein structures were aligned and superimposed using MUSTANG and SuperPose Version 1.0 30,31 . Web 3DNA (w3dna.rutgers.edu) was used for analysis of DNA helical parameters 32 .

Fluorescence anisotropy

6-carboxyfluorescein (6-FAM)-labeled template (5′-CTTAGGATGGAGAAAGGTAAGATGAAGCCG-3′) and primer, RNA (5′-CGGCUUCAUC-3′) or DNA (5′-CGGCTTCATC-3′) oligonucleotides were purchased PAGE purified from IDT Technologies (Coralville, IA). Purified labeled 30 mer oligonucleotide was mixed with 10 mer RNA or DNA oligonucleotide in 1:1 ratio and annealed by heating to 95 °C and permitting the sample to cool to room temperature to yield a 10-nt RNA-primer/30-nt DNA-template or 10-nt DNA-primer/30-nt DNA-template with one replicative end. Fluorescence emission intensities were collected on a Panvera Beacon 2000 fluorescence polarization system (at 23 °C), and the anisotropy values calculated as previously described 33 . Each reaction sample (total volume of 200 μl) consisted of 2 nM of 5′ FL-labeled RNA/DNA or DNA/DNA and increasing concentrations of the protein (from 0.1 nM to 16000 nM) in a binding buffer containing 50 mM Bis-Tris (pH 6.5), 100 mM NaCl and 5 mM MgCl2. The samples were left to equilibrate at room temperature for >30 min before the fluorescence anisotropy values were measured. Anisotropy values were referenced against a blank buffer at the beginning of each experiment to account for background correction. Anisotropy values were normalized by first subtracting the anisotropy value with no protein added and then dividing by the maximum anisotropy value for a particular RNA/DNA or DNA/DNA series. Fractional occupancy values were then plotted versus protein concentration, and the data fitted by nonlinear least-squares regression, by using Origin 7 (OriginLab), to the following equation:

where θ is the fraction of nucleic acid bound, Do is the total concentration of nucleic acid, Po is the total protein concentration, and KD is the dissociation constant.


Ver el vídeo: ADN Polimerasa (Junio 2022).


Comentarios:

  1. Adi

    Estoy totalmente de acuerdo con usted. Hay algo en esto y la idea es excelente, la apoyo.

  2. Yoshakar

    Está usted equivocado. Puedo probarlo. Escríbeme en PM, hablamos.

  3. Avinoam

    ¡Ninguna desgracia!

  4. Silviu

    ¡Mira mi casa!

  5. Maulrajas

    Lo siento, pero no podemos hacer nada.



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