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¿Qué plásmido puede expresar la ARN polimerasa T7 en células de mamíferos?

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¿Alguien sabe qué plásmido podría expresar la ARN polimerasa T7 en células de mamíferos? Me gustaría transfectarlo con otro plásmido que contenga el gen de interés bajo el control del promotor T7. ¡Muchas gracias!


Una secuencia líder capaz de mejorar la expresión de ARN y la síntesis de proteínas en células de mamíferos.

Brian P. Wellensiek, Andrew C. Larsen y Julia Flores contribuyeron igualmente a este trabajo.

Centro de Medicina e Informática Evolutiva, Universidad Estatal de Arizona, Tempe, Arizona, 85287-5301

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Departamento de Química y Bioquímica, Universidad Estatal de Arizona, Tempe, Arizona, 85287-5301

Centro de Enfermedades Infecciosas y Vacunación, The Biodesign Institute, Universidad Estatal de Arizona, Tempe, Arizona, 85287-5401

Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad Estatal de Arizona, Tempe, Arizona, 85287-5912

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Departamento de Química y Bioquímica, Universidad Estatal de Arizona, Tempe, Arizona, 85287-5301

Correspondencia a: John C. Chaput, 727 E. Tyler, Tempe, AZ 85287-5301. Correo electrónico: [email protected] Buscar más artículos de este autor

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Brian P. Wellensiek, Andrew C. Larsen y Julia Flores contribuyeron igualmente a este trabajo.

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T7 y DH5 alpha: ayúdame a aclarar algunas cosas (04 / Febrero / 2010)

Hola & # 33
Estoy haciendo mi tesis de maestría y estoy tratando de aclarar algunas cosas para entenderlas completamente. Ahora estoy investigando el sistema de expresión T7. Si entiendo bien las cosas, la ARN polimerasa T7 generalmente se incorpora al genoma cromosómico bajo el control de un operador lac que inicia la transcripción con la adición de IPTG. Luego, la polimerasa encuentra el promotor T7 en el plásmido y comienza a transcribir el ARNm de este sitio.

Sin embargo, leí en alguna parte que mi cepa bacteriana, DH5 alfa, no tiene su propio gen de polimerasa de ARN T7, y que esto debería estar presente en el plásmido y necesita ser transformado. ¿Es esto cierto? Estoy sospechando que no, porque no puedo ver que mis plásmidos (pTZ19R y pSE420) contienen tal cosa. ¿Podrías ayudarme a aclarar las cosas?

Lo que leíste es correcto. La mayor parte de la expresión de T7 se realiza en cepas de bacterias que se han lisogenizado con el fago DE3, que llevan la ARN polimerasa de T7 bajo el control del promotor lac. DH5a no tiene esto. Por lo general, las cepas que tienen esta modificación se indican en su nombre, como BL21 (DE3). La razón por la que la DH5a no suele llevar esta modificación es que es pobre para la expresión de proteínas, ya que todavía tiene la proteasa lon, que tiende a degradar las proteínas expresadas. La cepa BL21 está inactiva para esta y otras proteasas.

Sin duda, podría portar el promotor lac y el gen de la ARN polimerasa T7 en un plásmido (el mismo o uno cotransformante) en DH5a. Pocas personas hacen esto, porque se preocupan por la expresión de proteínas resultante.

Gracias por su respuesta & # 33 Esperaba haber hecho las cosas mal para que tuvieran más sentido. Volví a mi fuente original y clonaron mi gen en un vector de expresión pTZ19R y se transformaron en DH5a para su expresión. Si la DH5a es una cepa de expresión génica deficiente, ¿por qué querría alguien hacer eso? ¿Y cómo se produce la expresión si no hay polimerasa de ARN T7?

He intentado investigar el tema ahora, pero todo lo que hace es confundirme más. Encontré esto en algún documento de información de Invitrogen:
Importante: DH5 & # 945 E. coli no requiere IPTG para inducir la expresión del promotor lac incluso
aunque la cepa expresa el represor Lac. El número de copias de la mayoría de los plásmidos supera
el número de represores en las células. Si le preocupa obtener niveles máximos de
expresión, agregue IPTG a una concentración final de 1 mM.

Mi fuente original no menciona IPTG en absoluto, y asumí que era porque no querían dar toda la información sobre la producción de la proteína, pero ¿tal vez simplemente no la usan?

Además, he notado que obtengo resultados más claros en mi SDS-PAGE mientras uso un método que involucra PMSF. Mi opinión de los supervisores es que no es necesario, pero supongo que bloquearía la proteasa lon y tendría algún tipo de efecto. Probablemente haré más pruebas sobre eso, solo por diversión personal.

Ok, estoy balbuceando mis preguntas, pero las primeras son las más importantes. ¿Dónde está la polimerasa?

El plásmido pTZ19R tiene AMBOS un promotor lac y un promotor T7 corriente arriba de su sitio de clonación múltiple. En una cepa LacI-, esto se expresará a partir del promotor lac, sin tener nada que ver con el promotor T7. El promotor T7 está ahí para permitir la expresión en una cepa BL21 (DE3). Si me importara la proteína, subclonaría en BL21 (DE3) e induciría con IPTG, luego (como está haciendo) purificaría en presencia de PMSF, aunque eso es menos importante en las cepas BL21.


RESULTADOS

Vectores de ARN no citopáticos.

El replicón no citopático SINrep19 se diseñó como un vector de ARN subgenómico doble, utilizando el promotor 5 'para la expresión de genes extraños y un promotor 3' para impulsar la expresión de pac (Figura 1A). Las células BHK se transfectaron con replicones de ARN sintetizados in vitro, en placa y se dejó que se recuperara durante 12-18 h. Luego impusimos la selección de células que habían sido transfectadas productivamente con los replicones mediante la adición de puromicina al medio de cultivo celular. En 24 h, las células de control o no transfectadas se eliminaron por completo (I.F., E.A., T. A. Hoffman, B.M.P., M. S. Lippa, S.S. y C.M.R., datos no publicados).

Vectores SIN no citopáticos. (A) SINrep19 ARN, el vector de ARN no citopático subgenómico doble, transcribe genes extraños y pac gen de moldes de hebra negativa mediante el uso de promotores subgenómicos separados (las posiciones de los promotores se indican mediante flechas en las construcciones de ADN y ARN). (B) Un vector de ARN bipartito no citopático se basa en SINrep18 para respaldar la replicación de un genoma de SIN defectuoso e interferente que contiene un gen de interés. El extremo 5 'del ARN DI tiene una secuencia de ARNt Asp (20). (C) SINrep21 es un vector de ADN para el replicón SINrep19. Después de la transfección del ADN, los ARN replicones se transcribieron mediante enzimas nucleares y se transportaron al citoplasma. Los replicones inician la replicación autónoma y expresan la pac genes y genes extraños de interés. La escorrentía se refiere a sitios convenientes para la transcripción de escorrentía MCS, sitios de clonación múltiple.

Una comparación de la actividad total de β-gal proporcionada por SINrep19 /lacaZ con eso de otro SIN /lacaLos replicones Z se muestran en la Tabla 1. El replicón persistente produjo solo ≈4% de la actividad enzimática producida por el SINrep3 / citopático.lacaReplicón Z Esto está de acuerdo con los niveles reducidos de ARN SIN genómicos y subgenómicos observados en células transfectadas con el replicón no citopático parental (I.F., E.A., T. A. Hoffman, B.M.P., M. S. Lippa, S.S. y C.M.R., datos no publicados).

Expresión de β-gal por diferentes replicones SIN

Estrategias que utilizan ARN DI.

Una característica definitoria de las partículas DI de alfavirus es el aumento de los niveles de replicación del ARN en comparación con los virus de tipo salvaje o auxiliares (19). Los genomas DI apoyados por un replicón SIN no citopático también podrían exhibir niveles aumentados de replicación y, en consecuencia, una mayor producción de genes extraños. Para un SIN DI, se encontró que un determinante importante era la sustitución de una estructura similar al ARNt por el extremo 5 'auténtico de un genoma defectuoso (20). Los ARN DI que codifican genes heterólogos se construyeron basándose en esta estructura y se usaron junto con un replicón no citopático que contiene un único promotor subgenómico para impulsar pac expresión génica (SINrep18).

En una estrategia, los ARN DI se transfectaron en células pur R que ya replicaban SINrep18 (Fig.1B). Para distinguir fenotípicamente las células transfectadas con DI de las no transfectadas, se utilizó un segundo marcador seleccionable dominante. los neo El gen, que confiere resistencia al fármaco G418, se colocó junto al gen de interés y fue impulsado por el elemento interno del sitio de entrada del ribosoma del virus de la encefalomiocarditis. El di/lacZ-neo el vector produjo & gt20 veces el nivel de β-gal producido por SINrep19 pero ligeramente menor que el del replicón citopático (Tabla 1). Marcado metabólico de especies de ARN resistentes a actinomicina d en vivo indicó que los ARN de DI se replicaron a niveles más altos que los replicones no citopáticos solos y que DI /lacZ-neo-la expresión mediada fue estable después de múltiples pases incluso en ausencia de selección de G418 (datos no mostrados). Estos datos sugieren que un sistema de vector de replicón / DI es capaz de un alto nivel de expresión de genes extraños, muy probablemente debido a una mayor replicación del genoma de DI sobre el del replicón.

Para caracterizar aún más la capacidad de los replicones no citopáticos para complementar un vector DI, examinamos la capacidad de SINrep18 para inducir la expresión de luciferasa en células que transcriben constitutivamente DI /luc de un promotor nuclear. Esta transcripción sirve como plantilla para la replicación y transcripción tras la introducción de un virus auxiliar o replicón (11). Como demuestra la Tabla 2, las células no inducidas acumularon un bajo nivel constitutivo de actividad luciferasa que fue potenciada por la infección y proporcional a la cantidad de virus SIN añadida. Cuando estas células se transfectaron con SINrep18 seguido de selección de puromicina y pases, se acumuló abundante actividad luciferasa en los primeros 5 días y se mantuvo durante al menos otros 4 días. Por tanto, aunque los replicones no citopáticos expresan menos proteína por unidad de tiempo que sus contrapartes citopáticas, su capacidad de expresión prolongada puede conducir a la acumulación de niveles muy altos de proteína.

Inducción de luciferasa por replicones no citopáticos o virus SIN

Frecuencia de expresión de las células y estabilidad de las poblaciones celulares tras el paso.

La estabilidad de un vector de expresión a largo plazo define fuertemente su utilidad. Debido a que los virus de ARN, incluido el SIN, son genéticamente bastante plásticos, examinamos el patrón de expresión de β-gal a través de replicones no citopáticos, por célula, a lo largo del tiempo. Como demuestra la Fig.2, una población de células que replican SINrep19 /lacaZ contenía & gt10% de células negativas a beta - gal en los primeros pases y continuó acumulando células negativas a la expresión después de más pases. Se observó una pérdida de expresión similar para SINrep18 + DI /lacaZ (Fig. 2) y para otros genes marcadores (datos no mostrados). Por lo tanto, a pesar de la selección continua de puromicina, así como del hecho de que la lacaZ y pac los genes estaban ligados genéticamente, surgieron variantes de expresión negativa dentro de las poblaciones seleccionadas. Se consideraron dos fuentes principales de esta heterogeneidad: (I) es probable que los replicones acumulen mutaciones o deleciones en el lacaGen Z durante la replicación SIN y (ii) replicones se inician como una población, que debe reflejar la heterogeneidad de la in vitro ARN sintetizados.

Estabilidad de la expresión de β-gal por replicones no citopáticos. Durante el transcurso del pase celular (1:10, aproximadamente cada 48 h), una porción de células se sembraron en pozos separados y se tiñeron con X-gal como se describe en Materiales y métodos. La estabilidad de las líneas celulares clonadas que expresan β-gal se evaluó usando clones seleccionados para un alto nivel de expresión. El porcentaje de células negativas para β-gal se calculó mediante examen microscópico de varios campos aleatorios.

Para abordar la primera de estas preocupaciones. Examinamos la estabilidad de la expresión en poblaciones clonadas de células positivas para β-gal. Como se ve en la Fig.2, un derivado clonal de SINrep19 /lacaZ mantuvo & gt90% de expresión de β-gal a través de 10 pases. Se observaron resultados similares con múltiples clones de células (datos no mostrados). La estabilidad de SINrep18 + DI /lacaZ también mejoró al clonar una célula positiva para β-gal, aunque el porcentaje de expresión disminuyó en el décimo pase. Para poblaciones clonadas de SINrep19 /lacaZ y SINrep18 + DI /lacaZ, omitir la selección no tuvo ningún efecto sobre el porcentaje de células que expresan β-gal durante siete pases (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que la pérdida de expresión ocurre como resultado de la replicación SIN, pero esto no explica completamente la inestabilidad en las poblaciones no clonadas. En un sentido práctico, esta inestabilidad puede manejarse mediante el uso de células de pases tempranos y clonando directamente células con expresión positiva.

La alta tasa de mutación de la ARN polimerasa de SP6 puede contribuir a la heterogeneidad inicial dentro de una población de replicones. En vivo La transcripción de replicones de ARN funcionales mediante el uso de la ARN polimerasa II nuclear de la célula huésped podría ser una alternativa a in vitro transcripción, similar a las estrategias publicadas (21, 22). Este enfoque se probó primero construyendo p987 / SINrep19 / lacZ, que contenía el SINrep19 /lacaADNc de Z flanqueado por el promotor de repetición terminal de longitud 5 'del virus del sarcoma de Rous y la señal de poliadenilación 40 del virus del simio. La replicación de este replicón se inició mediante transfección transitoria de ADN plasmídico y selección de puromicina de poblaciones transfectadas. Tales poblaciones exhibieron una expresión prolongada de β-gal en & gt90% de las células, aunque se observó una pequeña pero detectable pérdida de expresión (Fig. 2). No se observaron diferencias en el nivel de expresión entre los productos expresados ​​en SINrep19 frente a p987 / SINrep19. Sobre la base de este diseño, se construyó un vector de ADN general, pSINrep21, en un vector de copia medio (Fig.1C).

Expresión de diversas proteínas heterólogas.

Algunos genes representativos expresados ​​mediante el uso de replicones no citopáticos se muestran en la Fig. 3. SINrep19 / GFP contiene una versión sintética optimizada por codones humanos de la Aequeorea victoria Gen GFP (12), que condujo a una fluorescencia brillante de poblaciones pur R (Fig.3A). Fig. 3B demuestra el patrón de tinción X-gal para un quinto pase SINrep19 /lacaPoblación de células que expresan Z.

Expresión de proteínas modelo a través de vectores no citopáticos. Las células se seleccionaron después de la transfección con SINrep19 / GFP (A), SINrep19 /lacaZ (B), SINrep19 / CD46 (C y mi) o SINrep18 (D y F). Todas las células eran poblaciones representativas seleccionadas para pur R como se describe en el texto. Las células se prepararon mediante tinción con X-gal (B) o tinción inmunofluorescente para CD46 (C y D). (mi y F) muestran el estado de las células 54 h después de la infección con MV [multiplicidad de infección (moi) 0,1].

Estábamos particularmente interesados ​​en usar replicones no citopáticos para entregar proteínas a la vía secretora porque una consecuencia de la infección por SIN puede ser la desregulación de estos compartimentos celulares (23). Expresamos la glicoproteína de superficie celular humana CD46, que participa en la regulación del complemento y es el receptor del virus del sarampión (MV). CD46 se expresó en la superficie de las células que replican SINrep19 / CD46 (Fig.3 C y D). Como este receptor es necesario para la unión y entrada de MV, probamos si la expresión de CD46 podría conferir permisividad de MV a las células BHK. Como se ve en la Fig.3 mi y F, una población de células SINrep19 / CD46 demostró la formación de sincitios típicamente inducida por la infección por MV, mientras que las células SINrep18 permanecieron no permisivas.

Además, se secretó una forma no anclada a membrana de fosfatasa alcalina placentaria humana (SEAP) en el medio de las células que replican SINrep19 / SEAP a una velocidad de 400 ng / 106 células / 24 h. De manera similar, una forma truncada de la glicoproteína E2 del virus de la hepatitis C (VHC), que carece de un anclaje transmembrana, fue glicosilada adecuadamente y dirigida para su secreción (datos no mostrados). Las proteínas estructurales prM / E del virus de la fiebre amarilla (YF) también se han expresado a través de SINrep19 y se procesan adecuadamente en prM y E (datos no mostrados). Estos datos muestran que los vectores SIN no citopáticos pueden suministrar proteínas biológicamente activas a la vía secretora.

Expresión de la ARN polimerasa de T7.

Examinamos la capacidad de los replicones no citopáticos para expresar la ARN polimerasa del fago T7 directamente a las células huésped. Esta enzima se administra comúnmente a células de mamíferos mediante el uso de un virus vaccinia recombinante, vTF7-3, y ha encontrado una amplia utilidad en la sobreexpresión transitoria de genes extraños clonados aguas abajo del promotor T7 y señales de traducción apropiadas (24). La función de la ARN polimerasa de T7 expresada a través de SINrep19 / T7pol se demostró mediante el uso de varios indicadores. En un conjunto de experimentos, transfectamos estas células con ADN plasmídico que contenía un clon funcional del virus Mengo bajo el control transcripcional del promotor T7. Como puede verse en la Fig.4A, la formación de placas de virus Mengo fue específica de las células que albergan SINrep19 / T7pol. Estas placas eran idénticas en tamaño y morfología al virus Mengo iniciado a partir de in vitro transcripciones (datos no mostrados).

Expresión funcional de la ARN polimerasa de T7. (A) Placas de virus Mengo después de la transfección de células BHK de control (SINrep18) o células BHK que expresan T7 (SINrep19 / T7pol) con un clon funcional dirigido por T7 del virus Mengo. (B) Expresión de la poliproteína del VHC con (carriles 2 y 3) o sin (carriles 1 y 4) transfección de pBRTM / HCV827–3011. Los carriles 1 y 2 se derivaron de células infectadas con vTF7-3, mientras que los carriles 3 y 4 representan células que contienen SINrep19 / T7pol. (C) Expresión de luciferasa después de la transfección de pEMCLucβgAnorte en células que expresan la ARN polimerasa de T7 a través de vTF7–3, SINrep19 / T7pol, o que no expresan la ARN polimerasa de T7 (control). Los lisados ​​se prepararon a las 6, 24 o 36 h después de la transfección. Este experimento es representativo de tres experimentos independientes.

En otro conjunto de experimentos, las células que expresan la ARN polimerasa T7 se transfectaron con pBRTM / HCV827-3011, un plásmido que contiene la región no estructural del VHC bajo el control del promotor T7 (25). Los productos esperados fueron inmunoprecipitados, lo que indica que la poliproteína del VHC se expresó y procesó correctamente (Fig.4B, carriles 3 y 4). A modo de comparación, también expresamos la polimerasa de fagos a través de vTF7-3, que produjo los mismos productos pero en mayor abundancia (Fig. 4B, carriles 1 y 2).

Para cuantificar mejor la cantidad de producto expresado en T7, examinamos la expresión de luciferasa a lo largo del tiempo en células transfectadas con un plásmido que codifica el gen luc impulsado por un promotor de T7, pEMCLucβgAnorte (un regalo de Jon A. Wolff, Universidad de Wisconsin). Las células que expresan la ARN polimerasa de T7 a través de vTF7-3 o SINrep19 / T7pol tenían abundante actividad luciferasa en todo momento examinado. Las células infectadas con vaccinia demostraron un pico de actividad más temprano, que disminuyó a las 36 h, consistente con la destrucción de las células infectadas por vaccinia. Por el contrario, SINrep19 / T7pol continuó acumulando luciferasa, superando la actividad en las células infectadas con vTF7-3 entre 24 y 36 h. Estos datos muestran que SINrep19 / T7pol puede expresar la ARN polimerasa de T7 funcional a un nivel comparable al de vTF7-3 pero con menos citotoxicidad.


CONCLUSIONES

Nuestros resultados muestran que un conjunto ortogonal de factores de transcripción sintéticos (con una fuerte actividad en el objetivo y baja fuera del objetivo) se puede construir en E. coli, y esto representa el primer sistema de activación programable en bacterias del que tenemos conocimiento, ampliando la gama de opciones disponibles para la actividad transcripcional en bacterias y ofreciendo la posibilidad de emplear la misma clase de enfoques basados ​​en el reclutamiento ya disponibles en organismos eucariotas.

En nuestro desarrollo del sistema iiT7, usamos la mutación de la ARN polimerasa de T7 y el truncamiento de su promotor pt7 de tipo salvaje para deteriorar las capacidades de unión al ADN del RNAP de T7, desacoplando así las funciones de reconocimiento del promotor y de iniciación transcripcional de T7 RNAP y permitiendo el reconocimiento del promotor para hacerse dependiente de una proteína de unión a ADN auxiliar. Se obtuvo una mejora significativa en el rendimiento al reemplazar la fusión covalente entre los dominios de unión al ADN con interacciones proteína-proteína (a través de nuestros pares de cremalleras de leucina), que desacoplaron aún más el proceso de unión al ADN del inicio de la transcripción y probablemente ayudaron a facilitar el escape del promotor y el alargamiento de la transcripción. .

Después de probar una variedad de variantes y optimizar su rendimiento, la forma actual de mejor funcionamiento del sistema iiT7 (representada por el gráfico de ortogonalidad en la Figura 3E) consiste en lo siguiente: una fusión de proteínas que incorpora un dominio de unión al ADN fusionado a una leucina cremallera (como ZFA5-LZ2A) una segunda fusión de proteínas que incorpora una cremallera de leucina seleccionada para formar interacciones proteína-proteína con la primera construcción y fusionada a un T7 RNAP (como LZ2B-T7) y un promotor que incorpora tanto la unión al ADN objetivo de la matriz de dedos de zinc y una secuencia promotora de T7 truncada (como p1zfa5-d1). Programar el sistema (crear nuevos objetivos) implica intercambiar los dominios ZFA e insertar las secuencias de unión de ADN coincidentes en el promotor. El ajuste de los niveles de activación resultantes se puede lograr variando la elección de dominios ZFA, dominios LZ o ambos. La cantidad de permutaciones disponibles para el ajuste podría salirse rápidamente de control, por lo que nuestro consejo para los diseñadores que buscan usar el sistema (especialmente si trabajan sin una tubería de cribado de alto rendimiento) sería seleccionar un par LZ y dejarlo fijo mientras exploran el Los niveles de actividad resultantes de variar solo los cambios de los dominios ZFA en los dominios LZ se pueden incorporar en una etapa posterior si es necesario, para ajustar los niveles de actividad.

Este sistema de RNAP basado en fagos de dos componentes en bacterias comienza a parecerse a la transcripción en eucariotas, donde los factores de transcripción reclutan RNAP centrales a promotores mínimos que tienen poca actividad o especificidad de forma aislada. Curiosamente, coincidiendo con la preparación de este manuscrito, Hillen et al. demostró mediante cristalografía que el RNAP mitocondrial humano (un homólogo del RNAP T7) utiliza un mecanismo muy similar al que hemos desarrollado aquí, donde el factor de transcripción mitocondrial TFAM sustituye a los ZFA en nuestro sistema (70). TFAM y el RNAP mitocondrial interactúan a través de dominios alfa helicoidales sorprendentemente similares a las cremalleras de leucina que hemos utilizado para el mismo propósito en nuestro sistema (Figura complementaria S8). Es reconfortante haber convergido involuntariamente en el mismo tipo de solución que miles de millones de años de evolución. Esta convergencia también se puede utilizar para informar direcciones futuras al sugerir que la fusión del ADN también puede desacoplarse aún más de la transcripción en RNAP ya que el segundo factor de transcripción mitocondrial TFB2M asumió este papel en el RNAP mitocondrial.

El sistema iiT7 ofrece un método prometedor para expandir el número de factores de transcripción sintéticos disponibles en contextos bacterianos, con la gran cantidad de componentes conocidos de ZFA y LZ que proporcionan la base para la construcción modular de bibliotecas de componentes ortogonales seleccionadas por el usuario, cada una con capacidad de alta actividad transcripcional al momento de la contratación. Con una mayor búsqueda del espacio mutacional de la polimerasa T7, puede ser posible encontrar un mutante con actividad transcripcional en ausencia de cualquier elemento del promotor T7 nativo, lo que simplificaría aún más el sistema.

Se descubrió una interesante divergencia en la utilidad con el mutante T7 RNAP HEP. Este mutante, aunque generalmente mejora la expresión en el objetivo de los promotores basados ​​en el truncamiento d1 de la secuencia del promotor pt7 (con la excepción de la fusión ZFA1-T7 (HEP)) en realidad resultó en una ortogonalidad general ligeramente disminuida debido a un aumento uniforme en off -actividad objetivo (Figura complementaria S9). Curiosamente, los mismos datos muestran que la escasa actividad en el objetivo de la fusión directa ZFA1-T7 (HEP) se restauró en la versión del sistema con puente LZ: ZFA1-LZ2A + LZ2B-T7 (HEP) tuvo un fuerte impacto en el objetivo. actividad, a un nivel casi idéntico al de su hermano ZFA2-LZ2A + LZ2B-T7 (HEP). Comprender la relación entre los dominios ZFA y su interacción con los RNAP fusionados y de otro modo unidos requiere una mayor investigación.

Tanto los dominios de unión al ADN como los de interacción proteína-proteína utilizados aquí pueden reemplazarse con nuevas variantes: hemos demostrado una versión del sistema basada en ZFA, pero en principio se puede emplear cualquier dominio de unión al ADN, incluido el activador transcripcional. como efectores (TAL) y dCas9. Separar el evento de unión al ADN del reclutamiento a través de interacciones proteína-proteína abre la posibilidad de ajustar o cambiar la actividad de los factores de transcripción sintéticos a través del número creciente de métodos conocidos de modulación de la interacción proteína-proteína externa, incluida la inducción química y de luz ( 71, 72). El complejo iiT7 dividido podría construirse alrededor de andamios de polinucleótidos y péptidos utilizando dominios de unión específicos de la modalidad, actuando como un sensor (73, 74) y permitiendo la sintonización para respuestas ultrasensibles (75). Se sabe que la polimerasa T7 RNAP opera en eucariotas (34), lo que abre la posibilidad futura de crear factores de transcripción sintéticos capaces de operar en procariotas o eucariotas. Aunque queda trabajo por hacer para desarrollar completamente el diseño iiT7, esta es una oportunidad no solo para probar la universalidad de los principios del diseño de transcripción, sino también para emular la evolución natural de los RNAP desde el simple fago de dominio único T7 hasta las polimerasas modulares y programables. de células complejas.


Libro de texto Canon: Expresando cualquier gen en bacterias - (09 / Ago / 2012)

Un examen superficial de los mapas de plásmidos muestra genes de resistencia a los antibióticos, pero ¿estos genes tienen promotores si (1) es "sí"?

El tema sobre el control de la expresión génica utiliza el operón como ejemplo. ¿Estos genes de antibióticos son inducidos por algo o están bajo algún control?

En los libros de texto, el flujo es siempre obtener el gen de interés, clonarlo y seleccionar la bacteria portadora del plásmido utilizando los marcadores antibióticos o la expresión del gen. Pero, ¿es así de sencillo o no se mencionan los detalles?

Creo que también hubo una publicación reciente sobre el gen sin promotor. Y otro sobre dos promotores. Ambos me confunden aún más.

Gracias a todos los que me guiarán pacientemente a través de esto.

Los genes deben transcribirse a ARN y luego traducirse a proteínas para que se expresen. La transcripción está controlada por promotores, 5 & # 39 de la región codificante de la proteína. Hay promotores 5 & # 39 de los genes de resistencia a antibióticos en plásmidos. Por lo general, estos son los llamados promotores constitutivos, lo que significa que siempre están en algunos genes de resistencia a los antibióticos que son algo tóxicos para las células, y los promotores de estos a veces pueden activarse selectivamente en presencia del antibiótico, pero esto es algo raro.
Los plásmidos comunes utilizados para la clonación a menudo tienen un promotor 5 & # 39 del sitio de clonación, de modo que cuando se insertan regiones codificantes de genes en el sitio de clonación, el gen se expresa. Algunos de estos promotores son inducibles, es decir, pueden activarse y desactivarse dependiendo de la presencia de sustancias químicas específicas, como IPTG o arabinosa. Espero que esto ayude.

1) Para transcribir un gen, necesita un promotor para que la ARN polimerasa se una y produzca ARNm (dependiendo del promotor, es posible que también necesite un terminador) en el ARNm que necesita aguas arriba del codón de inicio, un rbs (sitio de unión al ribosoma ) para que el ribosoma se una y haga la traducción que da como resultado su proteína. Hay que tener cuidado de que el origen o la replicación (para multiplicar el plásmido dentro de la bacteria), el promotor y los rbs sean específicos de las bacterias si se utilizan bacterias para la expresión, o levadura si se utiliza levadura, etc. Es posible que un plásmido tenga un origen de replicación para bacterias para que puedas clonarlo en bacterias, y otro origen de replicación para levadura, para que uses el plásmido para expresión de levadura.
2) Vea la respuesta anterior con la adición de que si tiene una resistencia a los antibióticos, debe verificar para qué organismo es específico su promotor, es decir, tengo un plásmido que da resistencia a la ampicilina en bacterias y resistencia a la gentamicina cuando se usa para infecciones virales en células de insectos. . Por otro lado, aunque la resistencia a la gentamicina está en el plásmido, en las bacterias, esto no da resistencia a la gentamicina porque el promotor es específico para la expresión de células de insectos.
3) Vea la respuesta antes.
4) ¿Por fenotipo te refieres a la expresión de proteínas? Por lo general, la expresión de genes extraños no da un fenotipo que no sea la expresión de proteínas y un crecimiento más lento. A veces tengo un fenotipo cuando expreso proteínas que contienen ADN / ARN, ya que se une a cada ADN y ARN libres y se vuelve tóxico para la célula. Si se refiere a la expresión de proteínas como fenotipo, no es tan fácil como parece en el papel. Pero para responder a tu pregunta, no necesitas agregar un promotor, los vectores vienen con un promotor antes del sitio de clonación múltiple en el que debes insertar tu gen de interés, hay algunos detalles que la gente pasa por alto y luego se meten en problemas. Por ejemplo, para darle solo lo básico:
a) Hay cepas bacterianas de clonación como DH5alpha o XL1Blue que carecen de endonucleasas / recombinasas específicas que las hacen adecuadas para recuperar ADN en cantidades más grandes. Utiliza estas cepas para transformar tu reacción de ligación para obtener el plásmido final. Crezca lento.
Hay cepas de expresión como BL21 que carecen de proteasas específicas para mantener intacta la proteína expresada. Transforme el plásmido obtenido previamente en estas cepas y utilícelo para la expresión.
c) Existe una variante de BL21 llamada Gold que tiene la ventaja de carecer de endonucleasas / recombinasas y ser adecuada para la expresión, lo que da lugar a la posibilidad de transformar la reacción de ligación directamente en esta cepa y omitir el paso DH5alpha / Xl1Blue
d) Si está trabajando con vectores pET (que tienen el promotor T7) debe trabajar con cepas de expresión que tengan (DE3) en el nombre (lo que significa que pueden expresar la ARN polimerasa T7 que reconoce este promotor)
e) Hay casos en los que, aunque clonó todo correctamente, su proteína no se expresa o da como resultado cuerpos de inclusión o está mal plegada y fragmentada dentro de la bacteria. En estos casos, debe probar diferentes cepas de expresión, diferentes vectores con promotores de diferentes fuerzas, diferentes temperaturas de expresión, diferentes medios, diferentes etiquetas N-terminales que promueven el plegamiento, diferentes fragmentos de proteína porque las proteínas mayores de 50 kDa en bacterias son difíciles de expresar. (algunas personas dicen que más de 27 kDa)

The thing with two/multiple promoters is that there are vectors that are made in such a way that you can use them for expression in different organisms i.e. E coli and insect cells without needing to reclone the gene by having two promoters one after the other such that when in bacteria the RNA polymerase recognizes the bacterial promoter, when in insect cells, the insect cells RNA polymerase recognizes the insect cell promoter. i.e. pTriEX from Novagen,

What you have asked is an entire field of expertise. If this would be easy to explain in 1-2 pages, I wouldn't be needed in my job:) I could suggest some material for reading such as Unit 5.24 from Current Protocol in Protein Science: Strategies to Optimize Protein Expression in E. coli by DM Francis and R. Page. If you cannot access it from your lab, drop me a message with your email address and I will send it to you.

Thank you very much phage434 and ascacioc. I was reading about molecular biology to prepare ahead of my final year. I understand that I am still a long way out and I appreciate your taking the time to explain. Could not really sleep with so many question marks floating about but I am happy to put some of these away.

Just to note here: when I mentioned "phenotype", I was thinking along the line of a new "characteristics" conferred by the new gene. Maybe that was inaccurate and I got mixed up with Drosophila genetics The PET system is fascinating (first impression) but I am not looking to make so many proteins. Just mutant bacterial clones.

Going forward I am sure I will have more questions and I will try to find out the answers by myself first.

To just make a quick note on the phenotype thing: If you are refering to a particular characteristic confered by the gene: if you have a type of cell (bacteria, yeast, mamalian cell line) that is a mutant of a gene (deletion mutant), you can make a rescue experiment using a plasmid containing the gene you deleted from the chromosome. This means that the protein will be expressed from the plasmid and will make the cell healthy (behaving like wild type) again. Plasmids are not only for expression of proteins for purification towards biochemical analysis.

Yes, T7 promoters come from the T7 bacteriophage. Studier, who according to me is the father of cloning, has characterized the bacteriphage many years ago and came up with the idea of pET system. He did also other wonderful things in cloning and protein expression like the autoinduction media. If you have time, you could look up what other contributions he did to the field of cloning.

Indeed, there are many bacterial hosts. What I find important to know is to know what a K strain (cloning strain) and a B strain (expression strain) are. Also, if you start using them, you could start learning the genotyping codes. A strain comes with a certain genotype i.e. mutations and insertions of genes, which make it different to other strains. Basically, at this level you need to read only 1-2 lines of genotype code and be able to tell what is the use of this strain. But this is expert level. A good webpage for this is: http://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes But again, this is knowledge you have in your mind when you do only this for many years. Nobody will expect you to know these things (most of the PhD students around me are happy without even knowing that this wiki exists)

Your questions:
1) Good question. Nunca lo había pensado. When I have seen it this morning, I was like: why would you do this? But just for theoretical purposes (even though, I am not 100% sure about what I am saying next): I think that the gene will be transcribed from both promoters i.e. once by RNA polymerase binding to one promoter and another time by binding to the other promoter. On the other hand, it will be crowded in this area and this might lead to slowing down or to shorter mRNA fragments because I imagine that if the first RNA polymerase binds on the upstream promoter and there is also another RNA polymerase downstream, the the first one stumbles accross the second one and cannot continue would wait a while until it cannot move anymore and then detach. Anyhow, we do not do that
2) http://www.amazon.com/Molecular-Cloning-Laboratory-Manual-Edition/dp/0879695773/ref=pd_sim_sbs_b_1 This the the bible of molecular cloning. However, nobody buys this for their own (check the price). Each good lab has a copy. I learn usually from internet, like wikis. The companies that sell the strains/vectors have also good material e.g Novagen. Also, there is a good journal, low impact factor, but specific for this fiels: Journal of Protein Expression & Purification. I check it regularly for new things in the field (generally there are tricks you can learn from how people dealt with their specific protein). Also there is a series of protocols: Current Protocols in Protein Science, or Current Protocols in Molecular Biology. They are written book style but they are mainly online. Actually, this is a field that, in my opinion is based on knowledge, not experience. There is a certain practical experience one needs, but if one lacks the basic knowledge of what is what, he can do the same mistake over and over again.

Yes, been going from one page to another in openwetware.org. Some things make sense and others are totally foreign. Same goes for the genotype notation am looking at Biobricks at the moment and already scratching my head.

Thank you so much for the explanations, Andreea. Soy consciente de que.

A note on the two promoters situation (I asked a friend yesterday over lunch about this intersting question of yours and she had some additions):
-in the consideration that you are using a vector with its own promoter to clone a gene with natural promoter, and the gene is from the same organism as the vector is i.e. both promoters are recognized by the RNA polymerase that is present in the host, you get a mixture of mRNAs that have the following structure . vector promoter - vector rbs - original promoter - original rbs - AUGgene. and . original promoter - original rbs - AUGgene. (rbs = ribosome binding site).
-the rbs is not a precise sequence, it is 6 consequent nucleotides enriched in As and Gs. Moreover, it is 6-8 bases upstream of the AUG
-in the second construct everything is fine
-in the longer construct (which is most probably the abundant one since expression vector promoters are the strongest found in nature to make your host express mostly your protein) you have a different story: there is a long strand of nucleotides from the 5' end up to the original rbs (the right one for the right AUG) that might be, coincidently, detected as a rbs (the odds are that there are a lot of 6 consecutive A/Gs) and then the ribosome will look for a AUG donwstream the fake rbs and start translation. Again the odds are that there are other AUGs out of frame in this long extra strand of nucleotides. This might lead to the wrong protein being translated.

This is why we do not do this:) We don't like to gamble. If we want the original promoter (which sometimes is the case), we clone the gene with the promoter in such a way to get rid of the original promoter in the vector. If we do not insist on the natural promoter (which anyhow is a weak one, most of them are), we clone only the gene.

A little bit hijacking this topic, but if I understand it correctly there are 2 vectors: expression vectors and cloning vectors (or strains).

The cloning vectors are vectors that provide the possibility to clone (duplicate the plasmid?) the genes you want (stable transfer of the plasmid during cell division?). I assume these are high copy vectors and vectors that maintain the plasmid very stable in high copy numbers?
While expression vectors are vectors that provide everything for a stable expression, translation?

But what are the molecular differences between those? I noticed you mentioned the the lack of proteases in expression strains and the lack of endonucleases/recombinases in cloning vectors, but are there other specific differences?
(eg: high copy in cloning vs low copy in expression? Or a very strong promoter in the exrepssion vectors?).

There are 2 strains you use for the same vector: cloning strain (K strain e.g. DH5alpha, XL1Blue) is the one with mutant dnases and recombinases and expression strain (B strain e.g BL21, Rosseta etc) is the one with mutant proteases.
In the K strain your ligated plasmid would be nicely transformed since there are minimum dnases and recombinases to affect it. These strains grow slow but have great transformation efficiency. They are also very easy to make competent using the Hanahan method which was actually developed for K strains. These strains are used mainly for plasmid production for mini/midi preping.
In the B strain, your protein will be nicely expressed and protected from the proteases, so it can accumulate up to the harvest time. Minimum preoteases to chop your protein up. Grow faster but have terrible transformation efficiency.
The story behind the original B-strains and K-strains is long. Initially, they were doing this old fashion UV-mutation/selection for the nice bacterial strains that people wanted to have. So they obtained strains to suit them but with lots of mutations. Hence, there are quite a few differences on the genome level between the strains. For more details, I recommend:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19765592 (as I said, Studier writes all the nice articles )
The normal workflow from gene to protein in bacteria: PCR your insert with overhangs for the restriction enzymes you want to use restrict digest the vector and the insert with these enzymes ligate vector and insert transform in K strain and plate check the ontained colonies for the right insert by colony PCR miniprep a few of them and send for sequencing once sequence confirmed, transform the plasmid in B-strain and do the expression of your protein in the B-strain.

Now, this is the classical way (details omitted for simplicity do not take it as a protocol there are some steps in between that are essential such as PCR clean up. ). If you for example want to transform an epPCR library or any kind of library of variants and select based on expression of your protein, then you cannot wait to obtain the plasmid from K strain, you have to go directly to the B-strain. So, in this case, due to the fact that nowadays we have a bit of more knowledge of how to manipulate bacteria, beyond UV, people have modified the classical BL21(DE3) to get BL21-Gold(DE3) (and similar strains) which has the advantage that it is also a mutant of endonucleas A (as K strains are, but this one is done nicely with modern molecular biology methods not UV ) Now, you will be tempted to say, hack, why should I use the long way and not transform the ligation directly to BL21(DE3)-Gold? Well, you could do that, but I personally do not like strains with too many mutations (endonuclease A is needed in the bacteria) because they are not too healthy and stressed bacteria do not produce tons of protein. But this is just me.

Another question that might arise would be: why do you go through K-strain until the expression strain:
1- easy to transform ligation reaction into if you use BL21(DE3) for transforming you might end up with no clones, but you might also be lucky. The question is: do you want to play the lotery in the lab?
2 - easy to mini/midiprep your plasmid to have enough for sequencing or other things for which you need ug amounts. Again, nobody says you cannot miniprep from BL21, but you need to be good at. I minipreped successfully from B strains, but I am a mixture of luck and good hands:) I have seen people not being able to miniprep from B-strains. So again: how lucky do you feel to do that? You might end up repeating the entire cloning procedure because you were too lazy to go through the K-strain. (we have a saying in my language: the lazy one, runs more I thought appropriate to insert some wisdom from the elders here )

This was the story about the strains = living organisms that multiplicate on their own. Not to be confused with plasmids: round pieces of DNA that is not able to multiply on its own. For simplicity, I will refer from now own only to bacterial plasmids, even though the parts are common for many other plasmids.
In a plasmid you generally have:
-origin of replication - needed by the bacteria to recognize the plasmid for replication these origins are that thing that give the copy number you can have high copy number plasmids (100 copies per cell) or low copy number plasmids (1-10) this is regulated by the origin of replication. In general, for expressing proteins, you want a low copy number plasmid. But for cloning in bacteria a plasmid to be used for mammalian cell culture imaging or for yeast protein expression, basically to be used in another organism, then you use a high copy number plasmid.
-antibiotic resistance - with its own constitutive promoter and terminator produces protein to clear the antibiotic makes the bacterium survive in the certain antibiotic used for selection
-promoter - used for transcription of mRNA from your insert
-terminator -stops mRNA transcription
-rbs - ribosome binding site - ribosome recognition site for translation to happen
-MCS - multiple cloning site with various restriction sites for you to put your insert into
These are the minimum components you have on an expression vector in bacteria. On top, you have some other regulatory components. But this is advanced molecular biology I will let you discover on your own

Hi carlmartin and Andreea,

Am I correct in saying that since we don't want to "gamble" with the outcome , it also follows that when one wishes to express a protein, it is crucial that the 'thing' downstream of the promoter be an ORF? Or else, we'll have a situation similar to the two-promoter scenario in our hands.

lyok on Sat Aug 11 09:22:22 2012 said:

I could be wrong but I understand both clonación y expresión vectors as genetic elements independent of their copy number. While the term expression vector seems to bring to mind a vector used for the overproduction of proteins for purification, a cloning vector can be an 'expression' vector by virtue of it having a promoter (err. right?).

In a rescue / complementation experiment, I believe that plasmids such as the pUC or pGEM with their respective promoters and being in the right environment would be expressed and restore the host.

As for stability and maintenance, it does appear to me in the beginning that high copy number is more superior to low copy one but after some digging found that the latter can be stably maintained too.

ascacioc on Sat Aug 11 10:32:24 2012 said:

I guess certain things are just like that . Brings to mind a discussion I had a while back with someone here regarding copy number and the resulting mRNA and protein but that's for another topic.


Información de soporte

Figura S1.

Expression of eYFP-NLS decreases as the space between the promoters increases. Western blot probed with anti-GFP. The levels of eYFP-NLS expression were normalised against the BiP loading control. Two independent clones of each plasmid were examined and the percentage of cells fluorescent after induction is shown.

Figura S2.

Flow cytometry analysis of Lister 427 pSPR2.1 p3227 and Lister 427 p3383. Two independent clones of each cell line were analysed with the typical result presented here. Red line untransformed Lister 427 pSPR2.1, black line uninduced, green line 18 hours tet induction.

Cuadro S1.

Table describing inducible tagging plasmids produced.

Cuadro S2.

Table describing plasmids used in this study. pLEW100 is described in Wirtz et al. [2]. p2948 and pDEX377 are described in Kelly et al. [8].

Cuadro S3.

DNA sequences of all the plasmids used in this study.


Associated Data

Designing and building multigene constructs is commonplace in synthetic biology. Yet functional successes at first attempts are rare because the genetic parts are not fully modular. In order to improve the modularity of transcription, we previously showed that transcription termination in vitro by bacteriophage T7 RNA polymerase could be made more efficient by substituting the standard, single, TΦ large (class I) terminator with adjacent copies of the Vesicular Stomatitis Virus (VSV) small (class II) terminator. However, in vitro termination at the downstream VSV terminator was less efficient than at the upstream VSV terminator, and multigene overexpression in vivo was complicated by unexpectedly inefficient VSV termination within E. coli células. Here, we address hypotheses raised in that study by showing that VSV or preproparathyroid hormone (PTH) small terminators spaced further apart can work independently (i.e. more efficiently) in vitro, and that VSV and PTH terminations are severely inhibited in vivo. Surprisingly, the difference between class II terminator function in vivo versus in vitro is not due to differences in plasmid supercoiling, as supercoiling had a minimal effect on termination in vitro. We therefore turned to TΦ terminators for 𠇋ioBrick” synthesis of a pentameric gene construct suitable for overexpression in vivo. This indeed enabled coordinated overexpression and copurification of five His-tagged proteins using the first construct attempted, indicating that this strategy is more modular than other strategies. An application of this multigene overexpression and protein copurification method is demonstrated by supplying five of the six E. coli translation factors required for reconstitution of translation from a single cell line via copurification, greatly simplifying the reconstitution.


Competent Cell Selection Guide

There are many properties to consider when choosing a strain for your experiments. Requirements such as plasmid preparation, blue/white screening, cytoplasmic disulfide bond formation, and fast colony growth necessitate specific strain choices. The following selection chart highlights the characteristics and formats of NEB&rsquos strains to help select the optimal strain for a particular experiment. The free online tool, NEBcloner can also be used to help select competent cells. For more information, please visit Cloning Competent Cell Strains or E.coli Expression Strains.

CAUTION: Chemically Competent E. coli contain DMSO, a hazardous material. Review the MSDS before handling.

Cloning Strain Properties

  • Dam/Dcm methyltransferase free plasmid growth
  • Fastest growth &ndash colonies visible after 6.5 hours
  • Plasmid preparation after 4 hours
  • Versatile cloning strain
  • DH5&alpha&trade derivative
  • Toxic gene cloning
  • F´ strain with extremely high transformation efficiency
  • Large plasmid and BAC cloning
  • DH10B&trade derivative
  • Cloning unstable inserts
  • Isolating and propagating retroviral/lentiviral clones
  • Ideal for subcloning efficiency transformations, such as plasmi transformation or routine subcloning

Protein Expression Strain Properties

  • Versatile non-T7 expression strain
  • Protease deficient
  • Routine T7 expression
  • Tunable T7 expression for difficult targets
  • Improved purity of target proteins isolated by IMAC
  • Routine non-T7 expression
  • Most popular T7 expression strain
  • Protease deficient
  • T7 expression
  • Protease deficient
  • Better reduction of basal expression
  • T7 expression
  • Protease deficient
  • Highest level of expression control
  • T7 expression/K12 strain
  • Enhanced capacity to correctly fold proteins with multiple disulfide bonds in the cytoplasm
  • Protease deficient/B strain
  • Enhanced capacity to correctly fold proteins with multiple disulfide bonds in the cytoplasm
  • T7 expression
  • Protease deficient/B strain
  • Enhanced capacity to correctly fold proteins with multiple disulfide bonds in the cytoplasm
  • T7 expression
  • Protease deficient/B strain
  • Tightly controlled expression of toxic proteins
  • Enhanced capacity to correctly fold proteins with multiple disulfide bonds in the cytoplasm
  • Control of IPTG induced expression from Placa, Ptac, Ptrc and T5laca
  • Protease deficient

(1) Rhamnose solution is provided instead of SOC control plasmid is included.
(2) Important for high-quality plasmid preparation.
(3) Lacks Lon and OmpT protease activity.
(4) Constitutively expresses a chromosomal copy of the disulfide bond isomerase DsbC.
(5) nit = nitrofurantoin, tet = tetracycline, cam = chloramphenicol, str = streptomycin, spec = spectinomycin
(6 )Resistance to low levels of streptomycin may be observed.
(7) Legend 50 = 50 µl tubes 200 = 200 µl tubes 96 = 96 well plate 384 = 384 well plate strips = 96 tube strips (50 µl/tube) 400 = 400 µl tubes
(8) 1-5 x 10 8 for R-format.
(9) 1-3 x 10 8 for P-format.


Characterization

Esquema

1) Expression of different proteins: monitoring growth

2) Expression of proteins with our backbone before and after optimization

3) SDS-PAGEs for the expression assay over the time of Full Construct (BBa_K3037003)

4) Image analysis of the expression in the SDS-PAGEs with ImageJ

Experiments in Detail

1) Expression of different proteins: monitoring growth

To evaluate the impact on the metabolic burden of over-expressing proteins, we tested different constructs cloned into our backbone. For this we used: HRP (BBa_K3037007) and our full construct (BBa_K3037003). After cloning, the constructs were expressed in E. coli pRARE T7 and we monitored growth over time (Figure 2). Induction of the system was performed after 165 min with 1 mM IPTG. Overall, the results prove that when expressed, none of our proteins inhibit growth.

2) Expression of proteins with our backbone before and after optimization

To use this backbone as convenient expression vector in iGEM, we had to include the Prefix and Suffix of the BioBrick Assembly. Subsequentially, we compared the expression of the original vector we recieved, pOCC97, to our optimized version for iGEM, BBa_K3730000.

We found that the original plasmid (= non-optimized) had a XbaI site, which we used to insert our BioBrick BBa_K3037003. This ilegal restriction site was later removed with an overhang PCR. The original XbaI restriction site was positioned downstream of the T7 polymerase promoter and upstream the RBS sequence of the plasmid. This way only BioBricks that already has a RBS fused to them could be expressed. Since we were using the RFC25 standard of Freiburg for our fusion proteins, the inserted protein contained already its own RBS in the Prefix.

However, we experienced on our own how difficult it is to add such a small sequence, as an RBS, to our other constructs. Therefore we redesigned the plasmid to be ready for expression in a single digestion+ligation reaction. We removed the XbaI restriction site and included a Prefix and Suffix of the RFC 10 standard after the RBS of the plasmid (=optimized).

We used the BioBrick assembly method to insert our BioBrick BBa_K3037003, which also has its own RBS due to the RFC25 standard.

In Figure 3, we show the expression of the protein BBa_K3037003 using both plasmids optimized (left) and non-optimized (right) and also different IPTG concentrations for induction and temperature.


The comparison of the growth curves shows that, the new plasmid adapted to the RFC 10 standard did not affect the growth, as it shows similar behavior compared to the original one (Figure 4).

3) SDS-PAGEs of the expression assays of the full construct (BBa_K3037003)

Down below follow several SDS-PAGEs of loaded crude cell extract (all normalized to an OD of 0.5) harvested at different time points pre- and post-induction. Used IPTG concentrations are indicated. Arrows indicate predicted size of the protein of interest.

Comparison of the expression of MBP-HRP (BBa_K3037008) and Full Construct (BBa_3037003)

Expression of full construct in pOCC97 not optimized at 18ºC

Expression of Full Construct in pOCC97 at 37ºC

Expression of Full Construct in pOCC97 optimized

4) Image analysis of the expression in the SDS-PAGEs with ImageJ

The previously shown SDS-pages were then further analysed by using the software ImageJ to correct for loading differences and be able to draw conclusions about the best conditions to express the Full Construct in pOCC97.


Temperature and IPTG induction dependence of the optimized pOCC97

Temperature and IPTG induction dependence of the not optimized pOCC97

Comparison between optimized and not optimized pOCC97


Based on this analysis, it can be concluded that optimal conditions for the expression of our fusion protein, BBa_3037003, is an overnight expression at 18ºC and inducing with 0.5 mM IPTG. We are proud to say that our optimized pOCC97 shows an increased expression and robustness under various conditions tested.


Ver el vídeo: pET expression vector (Mayo 2022).


Comentarios:

  1. Rayhourne

    muy real

  2. Pickworth

    Sitio interesante

  3. Aodhfionn

    ¡Suerte!

  4. Ruairidh

    Quizás estoy de acuerdo con tu opinión



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