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D12. Acetilación y Metilación de Histonas - Biología

D12. Acetilación y Metilación de Histonas - Biología


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La acetilación de histonas es obviamente un método importante en el control de la transcripción de genes. Los autores encontraron que, en comparación con los sitios de fosforilación en proteínas, que se encuentran en regiones más desordenadas, los sitios de acetilación se encuentran en regiones más estructuradas con una estructura secundaria significativa.

La acetilación elimina la carga positiva en las cadenas laterales de lisina en un proceso reversible. Ya se ha establecido que la acetilación de las cadenas laterales de lisina fue un componente clave de la reparación del daño del ADN, ya que modifica las colas de las proteínas histonas que se encuentran en el ADN. Sin embargo, recientemente se ha demostrado que los efectos de la acetilación se extienden a la regulación de otras funciones celulares. Más comúnmente, la acetilación juega un papel en casi todas las funciones nucleares, pero también juega un papel sorprendentemente importante en las funciones citoplasmáticas. Una de las nuevas funciones celulares investigadas fue la participación de la acetilación en la regulación de los complejos macromoleculares dentro de la célula que pertenecen a funciones como la transducción de señales, la reparación del daño del ADN y el ciclo celular. Una proteína de ejemplo incluida en el estudio es la proteína 14-3-3 que se une específicamente a la fosfoserina o fosfotreonina en péptidos fosforilados. Cuatro lisinas diferentes en la proteína se mutaron a glutamina en un intento de determinar el efecto de la acetilación sobre la unión de la proteína. Se descubrió que la acetilación regula la unión, ya que la actividad de la enzima se ve gravemente dañada por la mutación. Esto se ha visto en otros procesos celulares en los que la acetilación ha llevado a la regulación de la actividad enzimática. Además, el estudio descubrió que existe una interacción importante entre la fosforilación y la acetilación. Esta interacción o `` conversación cruzada '' entre la acetilación y otros métodos de modificación postraduccional en la regulación de la actividad celular también se ha observado en la proteína p53, que desempeña un papel importante en la reparación del ADN dañado. Los datos de acetilación se pueden encontrar en Phosida.

Las metáforas del lenguaje de la transcripción (decodificación de un ácido nucleico - ADN - en otro - ARN) y traducción (decodificación de un ácido nucleico escrito en el lenguaje de los ribonucleótidos en una proteína escrita en el lenguaje de los aminoácidos) pueden extenderse a modificaciones epigenéticas proteínas histonas en nucleosomas para producir el "código de histonas":

  • escritores: enzimas como las histonas acetiltransferasas y metiltransferasas modifican las histonas (en las cadenas laterales de Lys y Arg), especialmente en las colas que se extienden desde el nucleosoma;

  • borradores: enzimas como histonas desacetilasas y lisina desmetilasas
  • lectores: proteínas que reconocen y se unen a histonas modificadas postraduccionalmente, incluidas proteínas que contienen bromodominio (que reconocen las cadenas laterales de Lys metiladas) y proteínas de dominio de unión de metil-Lys y metil-Arg

Estas proteínas se están convirtiendo cada vez más en objetivos para el diseño de fármacos como una forma de alterar la transcripción de genes.


Modificaciones de histonas

La arquitectura de la cromatina, el posicionamiento nucleosómico y, en última instancia, el acceso al ADN para la transcripción de genes, está controlado en gran medida por proteínas histonas. Cada nucleosoma está formado por dos subunidades idénticas, cada una de las cuales contiene cuatro histonas: H2A, H2B, H3 y H4. Mientras tanto, la proteína H1 actúa como histona enlazadora para estabilizar el ADN internucleosómico y no forma parte del nucleosoma en sí.

Las proteínas histonas se someten a modificaciones postraduccionales (PTM) de diferentes formas, lo que afecta sus interacciones con el ADN. Algunas modificaciones interrumpen las interacciones entre las histonas y el ADN, lo que hace que los nucleosomas se desenrollen. En esta conformación de cromatina abierta, llamada eucromatina, el ADN es accesible para la unión de la maquinaria transcripcional y la posterior activación de genes. Por el contrario, las modificaciones que fortalecen las interacciones histona-ADN crean una estructura de cromatina muy compacta llamada heterocromatina. En esta forma compacta, la maquinaria transcripcional no puede acceder al ADN, lo que resulta en el silenciamiento del gen. De esta manera, la modificación de histonas por complejos remodeladores de cromatina cambia la arquitectura de la cromatina y la activación de genes.

Figura 1: Las modificaciones de histonas más comunes. Para obtener más información, consulte nuestro completo cartel de modificaciones de histonas

Juntas, estas modificaciones de histonas forman lo que se conoce como el código de histonas, que dicta el estado transcripcional de la región genómica local. El examen de las modificaciones de las histonas en una región particular, o en todo el genoma, puede revelar estados de activación de genes, ubicaciones de promotores, potenciadores y otros elementos reguladores de genes.

Modificaciones de histonas en detalle

Acetilación

La acetilación es una de las modificaciones de histonas más estudiadas, ya que fue una de las primeras que se descubrió que influye en la regulación transcripcional. La acetilación agrega una carga negativa a los residuos de lisina en las colas de histonas N-terminales que se extienden desde el nucleosoma. Estas cargas negativas repelen el ADN cargado negativamente, lo que da como resultado una estructura de cromatina relajada. La conformación de cromatina abierta permite la unión del factor de transcripción y aumenta significativamente la expresión génica (Roth et al., 2001)

La acetilación de histonas participa en la regulación del ciclo celular, la proliferación celular y la apoptosis y puede desempeñar un papel vital en la regulación de muchos otros procesos celulares, incluida la diferenciación celular, la replicación y reparación del ADN, la importación nuclear y la represión neuronal. Un desequilibrio en el equilibrio de la acetilación de histonas está asociado con la tumorigénesis y la progresión del cáncer.

Los grupos acetilo se añaden a los residuos de lisina de las histonas H3 y H4 mediante histonas acetiltransferasas (HAT) y se eliminan mediante desacetilasas (HDAC). La acetilación de histonas se dirige en gran medida a las regiones promotoras, lo que se conoce como acetilación localizada por el promotor. Por ejemplo, la acetilación de K9 y K27 en la histona H3 (H3K9ac y H3K27ac) generalmente se asocia con potenciadores y promotores de genes activos. También se encuentran niveles bajos de acetilación global en todos los genes transcritos, cuya función sigue sin estar clara.

Metilación

La metilación se agrega a los residuos de lisina o arginina de las histonas H3 y H4, con diferentes impactos en la transcripción. La metilación de arginina promueve la activación transcripcional (Greer et al., 2012) mientras que la metilación de lisina está implicada tanto en la activación como en la represión de la transcripción, dependiendo del sitio de metilación. Esta flexibilidad puede explicarse por el hecho de que la metilación no altera la carga de las histonas ni impacta directamente en las interacciones entre las histonas y el ADN, a diferencia de la acetilación.

Las lisinas pueden ser mono, di o trimetiladas, lo que proporciona una diversidad funcional adicional a cada sitio de metilación. Por ejemplo, tanto la mono como la tri-metilación en K4 de la histona H3 (H3K4me1 y H3K4me3) son marcadores de activación, pero con matices únicos: H3K4me1 típicamente marca potenciadores transcripcionales, mientras que H3K4me3 marca promotores genéticos. Mientras tanto, la tri-metilación de K36 (H3K36me3) es un marcador de activación asociado con regiones transcritas en cuerpos génicos.

Por el contrario, la tri-metilación en K9 y K27 de la histona H3 (H3K9me3 y H3K27me3) son señales represivas con funciones únicas: H3K27me3 es una señal temporal en las regiones promotoras que controla los reguladores del desarrollo en las células madre embrionarias, incluidos los genes Hox y Sox. Mientras tanto, H3K9me3 es una señal permanente para la formación de heterocromatina en regiones cromosómicas pobres en genes con estructuras repetidas en tándem, como repeticiones satélite, telómeros y pericentrómeros. También marca los retrotransposones y familias específicas de genes de dedos de zinc (KRAB-ZFP). Ambas marcas se encuentran en el cromosoma X inactivo, con H3K27me3 en regiones codificantes intergénicas y silenciadas y H3K9me3 predominantemente en regiones codificantes de genes activos.

La metilación de histonas es una marca estable que se propaga a través de múltiples divisiones celulares y durante muchos años se pensó que era irreversible. Sin embargo, recientemente se descubrió que es un proceso regulado activamente y reversible.

Metilación: histonas metiltransferasas (HMT)

  • Lisina
    • SET que contiene dominios (colas de histonas)
    • Que no contienen dominio SET (núcleos de histonas)
    • Familia PRMT (proteína arginina metiltransferasas)

    Desmetilación: histonas desmetilasas

    • Lisina
      • KDM1 / LSD1 (desmetilasa 1 específica de lisina)
      • JmjC (que contiene el dominio Jumonji)
      • PAD4 / PADI4

      Fosforilación

      La fosforilación de histonas es un paso intermedio crítico en la condensación cromosómica durante la división celular, la regulación transcripcional y la reparación del daño del ADN (Rossetto et al., 2012, Kschonsak et al., 2015). A diferencia de la acetilación y metilación, la fosforilación de histonas establece interacciones entre otras modificaciones de histonas y sirve como plataforma para las proteínas efectoras, lo que conduce a una cascada de eventos aguas abajo.

      La fosforilación ocurre en todas las histonas centrales, con efectos diferenciales en cada una. La fosforilación de la histona H3 en las serinas 10 y 28 y la histona H2A en T120 están implicadas en la compactación de la cromatina y en la regulación de la estructura y función de la cromatina durante la mitosis. Estos son marcadores importantes del ciclo celular y el crecimiento celular que se conservan en todos los eucariotas. La fosforilación de H2AX en S139 (que da como resultado γH2AX) sirve como punto de reclutamiento para las proteínas de reparación del daño del ADN (Lowndes et al., 2005, Pinto et al., 2010) y es uno de los primeros eventos que ocurren después de las roturas de la doble cadena del ADN. . La fosforilación de H2B no es un buen estudio, pero se encuentra que facilita la condensación de cromatina relacionada con la apoptosis, la fragmentación del ADN y la muerte celular (Füllgrabe et al., 2010).

      Ubicuidad

      Todas las proteínas del núcleo de las histonas pueden ubiquitilarse, pero H2A y H2B son las más comunes y son dos de las proteínas más ubiquitiladas en el núcleo (Cao et al., 2012). La ubiquitilación de histonas juega un papel central en la respuesta al daño del ADN.

      La monoubiquitilación de las histonas H2A, H2B y H2AX se encuentra en sitios de roturas de doble cadena de ADN. Las formas más comunes son H2A monoubiquitylated en K119 y H2B en K123 (levadura) / K120 (vertebrados). El H2A monoubiquitilado también se asocia con el silenciamiento de genes, mientras que el H2B también se asocia con la activación de la transcripción.

      La poliubiquitilación es menos común, pero también es importante en la reparación del ADN: la poliubiquitilación de H2A y H2AX en K63 proporciona un sitio de reconocimiento para las proteínas de reparación del ADN, como RAP80.

      Regulación enzimática

      Al igual que otras modificaciones de histonas, la monoubiquitilación de H2A y H2B es reversible y está estrechamente regulada por las histonas ubiquitina ligasas y enzimas desubiquitilantes.

      Monoubiquitylation

      Poliubiquitilación

      Guía de referencia rápida para modificaciones de histonas

      Modificaciones de histonas más comunes y dónde encontrarlas:

      Ubicación de la función de modificación de histonas

      Potenciadores de activación H3K4me1

      Promotores de activación H3K4me3

      Cuerpos génicos de activación H3K36me3

      Cuerpos génicos de activación H3K79me2

      Potenciadores de activación de H3K9Ac, promotores

      Potenciadores de activación de H3K27Ac, ​​promotores

      Secuencias repetitivas de activación de H4K16Ac

      Promotores de la represión H3K27me3, regiones ricas en genes

      H3K9me3 Repetición del satélite de represión, telómeros, pericentrómeros

      Daño del ADN de Gamma H2A.X Roturas de la doble hebra del ADN

      Replicación del ADN H3S10P Cromosomas mitóticos

      Estudio de modificaciones de histonas por ChIP

      ChIP usa anticuerpos para aislar una proteína o modificación de interés, junto con el ADN al que está unido (figura 5). Luego, el ADN se secuencia y se asigna al genoma para identificar la ubicación y abundancia de la proteína o modificación.

      Figura 2: ChIP de modificación de histonas. Los anticuerpos se unen directamente a las colas de histonas modificadas. La inmunoprecipitación y la purificación del ADN permiten el aislamiento y la identificación de las regiones genómicas que ocupan las modificaciones.

      El uso de anticuerpos contra histonas específicas y modificaciones de histonas en experimentos de ChIP puede revelar las ubicaciones específicas de

      • Estructuras de cromatina de orden superior, por ejemplo, H3K9me3 marca heterocromatina y repeticiones de satélite
      • Genes y programas genéticos activos o silenciados, por ejemplo, AH3K9ac marca la activación de genes
      • Elementos genéticos como promotores y potenciadores, por ejemplo, H3K27me3 marca a los promotores en regiones ricas en genes, H3K4me1 marca potenciadores activos

      Si se conoce la función de una modificación de histona, ChIP puede identificar genes y regiones específicos con esta firma de modificación de histona y la función correspondiente en todo el genoma. Estos genes y regiones pueden luego examinarse más a fondo para determinar su papel en el proceso biológico de interés. El uso de ChIP contra H3K4me1, por ejemplo, revelará las ubicaciones y secuencias de potenciadores activos en todo el genoma, apuntando a genes y programas genéticos de interés.

      Alternativamente, si no se conoce la función de la modificación de la histona, ChIP puede identificar secuencias, genes y ubicaciones con esta firma, que luego pueden usarse para inferir la función de la modificación. Esta técnica fue fundamental para decodificar gran parte del código de las histonas y sigue siendo valiosa para determinar la función de modificaciones recién descubiertas como la ubiquitilación y otras marcas novedosas.

      Enzimas modificadoras de histonas: escritores y borradores​

      Las modificaciones de histonas se agregan y eliminan dinámicamente de las proteínas de histonas mediante enzimas específicas (tabla 1). El equilibrio entre estos escritores y borradores dicta qué marcas están presentes en las histonas y a qué niveles, para controlar en última instancia si los programas genéticos específicos y los procesos celulares que orquestan están activados o desactivados.

      Tabla 1. Las principales categorías de escritores y borradores de histonas.

      Modificación

      Histonas acetiltransferasas (HAT)

      Histona desacetilasas (HDAC)

      Histonas metiltransferasas (HMT / KMT) y proteínas arginina metiltransferasas (PRMT)

      Para obtener más detalles sobre los lectores, escritores y borradores de modificaciones de histonas, consulte nuestro cartel de modificación epigenética.

      La identificación de las vías de modificación y los escritores y borradores específicos en juego puede revelar:

      • Vías celulares relevantes, programas genéticos y efectos fisiológicos para mayor investigación. Por ejemplo, las histonas desacetilasas (HDAC) activan las vías del desarrollo inmunológico, mientras que las histonas acetiltransferasas (HAT) desempeñan un papel crucial en la diferenciación y proliferación.
      • Desequilibrios entre escritores y borradores que alteran la programación genética y subyacen a los procesos patológicos. Caracterizar tales desequilibrios y las enzimas específicas involucradas puede proporcionar información sobre la patología de la enfermedad, desde cánceres hasta trastornos autoinmunes.
      • Nuevas dianas farmacológicas y estrategias terapéuticas. Una vez que se identifica un desequilibrio, se pueden desarrollar fármacos para impactar la actividad de estas enzimas y corregir el desequilibrio, ofreciendo nuevas estrategias terapéuticas contra enfermedades que hasta ahora han eludido los esfuerzos médicos. Por ejemplo, se están desarrollando muchos inhibidores de HDAC como fármacos novedosos contra cánceres y enfermedades inflamatorias como la artritis y la diabetes tipo I.

      Para los esfuerzos de desarrollo de fármacos, los compuestos pueden analizarse fácilmente por su impacto en la actividad de redacción y borrado.

      Caracterización de las vías de metilación de histonas

      En general, los ensayos de histona metiltransferasa (HMT) son difíciles de desarrollar y la mayoría tiene varios inconvenientes debido al diseño del ensayo. Los ensayos de HMT típicos utilizan 3 H-SAM como donante de metilo y miden la S-adenosilhomocisteína (SAH) como un subproducto general de la reacción de metilación. Sin embargo, esto requiere

      • Manipulación de material radiactivo
      • Alta sensibilidad para superar bajos kgato (rotación típicamente & lt 1 min-1) y KMETRO valores para el donante de metilo, SAM
      • Purificación previa de complejos de enzima / proteína para evaluar la actividad de HMT específicos

      Los ensayos de actividad de Abcam HMT superan estas dificultades, evaluando la actividad de HMT específicos con anticuerpos que detectan el producto metilado específico, proporcionando:

      • Fácil detección colorimétrica o fluorométrica, sin radiactividad
      • Compatibilidad con extractos nucleares o proteínas purificadas (el ensayo es específico para la modificación de interés)
      • Datos en 3 horas

      Para obtener más información sobre nuestros ensayos de metilación de histonas haga clic aquí.

      Caracterización de la actividad de la desmetilasa

      Los ensayos de actividad de histona desmetilasa típicamente miden la formación de formaldehído, un subproducto de la desmetilación. Por lo tanto, son susceptibles a la interferencia de detergentes, grupos tiol y una variedad de iones. De manera similar a los ensayos de metilación, estos ensayos no son específicos para ninguna desmetilasa y solo se pueden realizar con proteína purificada.

      Los ensayos de histona desmetilasa de Abcam evitan estos problemas midiendo directamente la formación del producto desmetilado, proporcionando:

      • Mayor sensibilidad (20 a 1000 veces) en comparación con los ensayos basados ​​en formaldehído
      • Datos más precisos sin interferencias de tioles, detergentes o iones
      • Compatibilidad con extractos nucleares o proteína purificada (debido a la especificidad del ensayo para la modificación de interés)
      • Mide la actividad desmetilasa de una amplia gama de especies, incluidas células / tejidos de mamíferos, plantas y bacterias.
      • Formato de microplaca rápido con lecturas colorimétricas o fluorométricas simples
      • Datos en 3 horas

      Para obtener más información sobre nuestros ensayos de histona desmetilasa haga clic aquí.

      Caracterización de las vías de acetilación de histonas

      Abcam ofrece kits para analizar la actividad HAT general y específica de H4. Estos ensayos miden la transferencia catalizada por HAT de grupos acetilo del donante de Acetil-CoA a los péptidos de histona, lo que genera el péptido acetilado y CoA-SH. El subproducto CoA-SH luego se mide mediante métodos colorimétricos o fluorométricos:

      • Ensayos colorimétricos: CoA-SH sirve como una coenzima esencial para producir NADH, que reacciona con el colorante de tetrazolio soluble para generar un producto que se puede detectar espectrofotométricamente. Este ensayo es ideal para estudios cinéticos, con detección continua.
      • Ensayos fluorométricos: CoA-SH reacciona con un revelador y una sonda para generar un producto que se detecta fluorométricamente.

      Caracterización de la actividad de la histona desacetilasa

      Las proteínas HDAC se dividen en cuatro grupos principales (clase I, clase IIA, clase IIB, clase III, clase IV) según la función y la similitud de la secuencia de ADN. Las clases I, IIA y IIB se consideran HDAC "clásicas" cuyas actividades son inhibidas por tricostatina A (TSA), mientras que la clase III es una familia de proteínas dependientes de NAD + (sirtuinas (SIRT)) no afectadas por TSA. La clase IV se considera una clase atípica por sí sola, basada únicamente en la similitud de la secuencia de ADN con las demás.

      Cada una de estas clases está asociada con diferentes programas celulares y puede ensayarse individualmente con varios ensayos fluorométricos. Por ejemplo, los SIRT se asocian típicamente con cánceres y enfermedades neurológicas. La detección de la actividad de SIRT o la identificación de fármacos que afecten a la actividad de SIRT pueden indicar nuevos diagnósticos o estrategias terapéuticas para estas enfermedades.

      Los ensayos fluorométricos utilizan un sustrato peptídico acetilado con un fluoróforo y un inhibidor en sus terminales amino y carboxilo. Una vez que el sustrato está desacetilado, puede ser escindido por una peptidasa, liberando el fluoróforo del extintor. El posterior aumento de la intensidad de la fluorescencia del fluoróforo es directamente proporcional a la actividad desacetilasa.

      Inhibir escritores y borradores

      Puedo ser útil para inhibir estas enzimas modificadoras usando moléculas pequeñas y luego evaluar las consecuencias posteriores para sondear la participación y las funciones biológicas de las modificaciones de histonas. Por lo tanto, los inhibidores de escritores y borradores son herramientas vitales para comprender las funciones de las vías de modificación epigenética. También son esenciales para la validación de objetivos "farmacológicos" en el contexto de estudios preclínicos tanto en contextos académicos como industriales.

      Lectores / traductores de modificación de histonas

      Las modificaciones de histonas regulan las propiedades físicas de la cromatina y su estado transcripcional correspondiente, ya sea directamente (por ejemplo, grupos acetilo que repelen el ADN cargado negativamente para crear una conformación de cromatina abierta) o mediante adaptadores de proteínas denominados efectores. Las proteínas efectoras reconocen y se unen a marcas epigenéticas específicas y, posteriormente, reclutan maquinaria molecular para alterar la estructura de la cromatina. Estos lectores epigenéticos determinan el resultado funcional de las modificaciones de histonas traduciendo el código de histonas en acción.

      Los dominios efectores reconocen modificaciones específicas de histonas

      Las proteínas efectoras reconocen y se unen a las marcas de modificación de histonas a través de dominios efectores, conocidos como módulos (Tabla 2).

      Tabla 2. Reconocimiento de marcas de histonas por módulos o proteínas de unión a histonas.


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      CIRCUITO Y MECANISMOS MOLECULARES DE DEPRESIÓN

      Los estudios post mortem y de neuroimagen de pacientes deprimidos han revelado que la depresión humana probablemente afecta a numerosas regiones del cerebro, lo que puede explicar parte de la complejidad y heterogeneidad del trastorno. Se han informado cambios funcionales en todo el circuito cortical-estriatal-límbico del cerebro, lo que sugiere una alteración de la cognición (corteza prefrontal (PFC) e hipocampo), procesamiento emocional (amígdala) y recompensa (núcleo accumbens (NAc)), y respuestas homeostáticas y de estrés (p. Ej. , eje hipotalámico-pituitario-suprarrenal o HPA) durante el curso de la depresión. Por ejemplo, los estudios han revelado una disminución del volumen de materia gris en la CPF y el hipocampo de individuos deprimidos (Drevets, 2001 Harrison, 2002 Sheline, 2003), hipermetabolismo en la amígdala y las regiones corticales frontales (Drevets, 2003, 2007 Drevets et al, 2008). Fu et al, 2004), alteraciones en la morfología de la columna (Christoffel et al, 2011) así como disminución de la activación del NAc en respuesta a estímulos gratificantes (Epstein et al, 2006), e hiperactividad del eje HPA (Gold y Chrousos, 2002).

      Se cree que las adaptaciones moleculares que ocurren a lo largo de los circuitos cortical-estriatal-límbico en modelos humanos y animales de depresión son la base de los cambios morfológicos y funcionales que contribuyen al estado de la enfermedad (Figura 1). Los estudios post mortem en humanos han revelado una disminución del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) en el hipocampo de pacientes que sufren depresión (Dwivedi et al, 2003). El BDNF, el miembro más activo de la familia de las neurotrofinas, regula la diferenciación y el crecimiento neuronales (Benraiss et al, 2001 Pencea et al, 2001), y la disminución observada en la depresión puede contribuir a la reducción del volumen del hipocampo que se observa en pacientes deprimidos. Los niveles reducidos de BDNF del hipocampo se corroboran en los paradigmas de estrés tanto agudo (Barrientos et al, 2003) como crónico (Nibuya et al, 1995) en animales. La evidencia de que el tratamiento con antidepresivos en humanos y animales causa un aumento en el BDNF del hipocampo, y que las respuestas antidepresivas se pierden con la desactivación del BDNF, sugiere que esta adaptación molecular es relevante para parte de la sintomatología de la depresión (Coppell et al, 2003 Gervasoni et al, 2005 Monteggia et al, 2007 Nibuya et al, 1995 Shimizu et al, 2003 Xu et al, 2003). Curiosamente, se ha informado de un perfil hipocampal similar para varios otros factores de crecimiento, como VGF, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y su receptor (VEGF tipo 2), en modelos de estrés crónico (Heine et al, 2005 Thakker et al, 2007 Warner-Schmidt y Duman, 2007). Además de la disminución de los factores de crecimiento neuronal, los modelos de estrés tanto agudo como crónico en roedores producen un aumento en la señalización de las citocinas proinflamatorias del hipocampo IL-1β y NF-κβ, adaptaciones moleculares que están vinculadas tanto a fenotipos similares a los depresivos como a una disminución de la proliferación de células del hipocampo ( Goshen et al, 2008 Johnson et al, 2005 Koo y Duman, 2008 Koo et al, 2010).

      Circuitos con adaptaciones moleculares superpuestas a diferentes regiones del cerebro. Varias regiones del cerebro están implicadas en la fisiopatología de la depresión. Aquí se muestran ejemplos de adaptaciones moleculares que ocurren en los sistemas glutamatérgico, dopaminérgico (área tegmental ventral, VTA) y GABAérgico en humanos deprimidos y / o después de estrés crónico en modelos de roedores. Los cambios resaltados en rojo se revierten con el tratamiento crónico con antidepresivos.

      Los pacientes deprimidos y los animales sometidos a estrés crónico exhiben alteraciones estructurales en el PFC, incluida la disminución del volumen de PFC y la retracción dendrítica y la pérdida de la columna vertebral (Cook y Wellman, 2004 Drevets, 2000, 2001 Goldwater et al, 2009 Liston et al, 2006). Los pacientes deprimidos también muestran niveles reducidos de las subunidades del receptor de glutamato NMDA NR2A y NR2B, así como una reducción en PSD-95, todos los cuales son cruciales para la integridad estructural y la función de las espinas dendríticas (Gambrill y Barria, 2011). El estrés crónico disminuye los niveles de BDNF en el PFC (Fumagalli et al, 2004) y, al igual que en el hipocampo, los niveles aumentan después del tratamiento con antidepresivos (Balu et al, 2009). Curiosamente, el neuropéptido Y, que antagoniza las acciones de la hormona liberadora de corticotropina (Giesbrecht et al, 2010 Heilig, 2004), también disminuye en la PFC de pacientes deprimidos y víctimas de suicidio (Caberlotto y Hurd, 2001 Widdowson et al, 1992). Una complicación adicional a los enfoques moleculares en el tratamiento de la depresión es que las adaptaciones moleculares no ocurren a nivel mundial, pero a menudo son específicas de la región y el tipo de célula. Por ejemplo, a diferencia de lo que se ha observado en el PFC, tanto el NR2A como el PSD-95 aumentan en la amígdala de los seres humanos deprimidos (Karolewicz et al, 2009).

      Se ha planteado la hipótesis de que la NAc, mejor establecida por su función en el procesamiento de la información de recompensa, es la base de los síntomas de la anhedonia en pacientes deprimidos (Nestler y Carlezon, 2006). Gran parte de lo que se sabe sobre las adaptaciones moleculares en la NAc en la depresión se ha derivado de los paradigmas de estrés crónico en roedores, en particular el paradigma de la derrota social crónica, con la mayoría de los hallazgos clave validados en la NAc de los seres humanos deprimidos. Una ventaja de la derrota social crónica es que los ratones muestran respuestas fenotípicamente divergentes, con algunos animales mostrando susceptibilidad y otros demostrando resiliencia (Krishnan et al, 2007), un fenómeno que podría traducirse en diferencias en la vulnerabilidad al estrés observada en humanos. Los niveles de BDNF aumentan en el NAc después de la derrota social crónica en animales susceptibles, pero no en sus contrapartes resilientes (Berton et al, 2006 Krishnan et al, 2007). Además, este aumento selectivo en BDNF, demostrado también en la NAc de humanos deprimidos, está asociado con la activación de moléculas de señalización aguas abajo como el oncogén viral de timoma akt fosforilado y la quinasa regulada por señales extracelulares (Berton et al, 2006 Krishnan et al, 2007 Wilkinson et al, 2011). Evidencia más reciente sugiere una distinción molecular similar entre susceptibilidad y resiliencia en la cascada de señalización Wingless (WNT) en el NAc, con regulación negativa de la señalización WNT-disheveled (DVL) y regulación positiva asociada de la señalización de la glucógeno sintasa quinasa 3β en ratones susceptibles, pero regulación positiva en ratones susceptibles. ratones (Wilkinson et al, 2011). La regulación a la baja de la señalización de WNT-DVL se corroboró en la NAc de pacientes humanos deprimidos examinados post mortem. Los cambios en la morfología de la columna NAc después del estrés por derrota social crónica, específicamente, un aumento en las espinas rechonchas con densidades postsinápticas más pequeñas en las neuronas espinosas medianas NAc, también son específicas de los animales susceptibles y están ausentes en aquellos que demuestran resiliencia conductual (Christoffel et al, 2011). Esta adaptación parece estar mediada por la inducción de la quinasa IkB, que es un objetivo aguas abajo del BDNF y varios otros factores neurotróficos y un regulador conocido de la morfología de la columna (Russo et al, 2009).

      Las observaciones en el modelo de derrota social crónica, de que ratones con antecedentes genéticos idénticos no solo muestran diferencias en el desarrollo de respuestas anhedónicas después de la exposición al mismo estrés ambiental, sino que también muestran diferencias en el desarrollo de adaptaciones moleculares en regiones del cerebro comprometidas en la depresión, sugiere una interacción entre los genes y el medio ambiente que puede regularse mediante mecanismos epigenéticos. De hecho, varios reguladores de la estructura de la cromatina se alteran en la depresión humana y en modelos animales que implican estrés crónico, como se verá a continuación.


      Resultados

      Reprogramación dinámica de la acetilación en los residuos de lisina 9 y 14 de la histona H3 en el primer ciclo celular de embriones clonados

      La modificación de acetilación en los residuos de lisina 9 y 14 en la histona H3 del núcleo de la célula somática experimentó cambios dramáticos tras la inyección del núcleo de la célula somática en el ovocito enucleado y el tratamiento de activación posterior. Como se muestra en la Figura 1A, H3K9 no está acetilado en los cromosomas de los ovocitos MII. H3K9 no sufrió modificación de acetilación en ambos genomas parentales hasta 6 h después de la inyección intracitoplasmática de espermatozoides, y ambos pronúcleos exhibieron la misma modificación de acetilación de H3K9 (panel ICSI, Fig. 1, P – T). En comparación con los ovocitos MII, las células somáticas mostraron niveles muy altos de acetilación de H3K9 en el núcleo, que se puede observar en el ovocito reconstruido 10 min después de la inyección del núcleo de células somáticas (Fig. 1B). Tras la rotura de la envoltura nuclear y la condensación de los cromosomas, la acetilación de H3K9 se eliminó rápidamente del genoma de las células somáticas. No se pudo observar acetilación de H3K9 en los cromosomas de las células somáticas 1 h después de SCNT (Fig. 1, C – E). Después de la activación, la consecuencia de la restauración de la acetilación de H3K9 en los pseudo-pronúcleos fue similar a la de los embriones ICSI normales, excepto que la intensidad de la acetilación de H3K9 en los embriones clonados fue mucho más débil que en los embriones normales (Fig. 1, F – J) , mientras que se logró una intensidad similar de acetilación de H3K9 en los pseudo-pronúcleos en los embriones clonados tratados con TSA en comparación con los embriones normales (Fig. 1, K – O). De manera similar a la acetilación de H3K9 en el ovocito MII, H3K14 no se acetiló en los cromosomas MII, como se muestra en la Fig. 2A. Sin embargo, la acetilación de H3K14 se produjo en ambos genomas parentales mucho más rápidamente que la acetilación de H3K9 después de ICSI.H3K14 experimentó acetilación en ambos genomas parentales cuando el ovocito todavía estaba en la etapa de telofase II y los cromosomas permanecieron condensados ​​3 h después de ICSI (Fig. 2R). La acetilación de H3K14 en ambos genomas parentales alcanzó niveles máximos 10 h después de ICSI (Fig. 2, S y T). En comparación con los embriones normales, la acetilación de H3K14 en embriones SCNT mostró modificaciones dinámicas después de la inyección y activación del núcleo. Como se muestra en la Figura 2B-2E, H3K14 estaba altamente acetilado en el núcleo de la célula somática y la intensidad disminuyó junto con la ruptura de la envoltura nuclear y la condensación cromosómica después de SCNT. La acetilación de H3K14 se eliminó 3 h después de la inyección del núcleo. La restauración de la acetilación de H3K14 en embriones clonados ocurrió después de la activación, y la acetilación de H3K14 exhibió patrones diferentes en embriones clonados con o sin tratamiento con TSA (Panel de clones, Fig. 2, Panel de F – J Clon + TSA, Fig. 2, K – O) . La restauración de la acetilación de H3K14 ocurrió mucho más rápidamente en los embriones clonados tratados con TSA cuando los cromosomas se separaron en dos grupos 3 h después de la activación, mientras que los clones no tratados recuperaron la acetilación de H3K14 6 h después de la activación y los cromosomas ya se habían descondensado (panel Clon + TSA , Fig. 2M Panel de clonación, Fig. 2I). En comparación con los embriones normales, los clones tratados con TSA mostraron una intensidad similar de acetilación de H3K14 mientras que la intensidad de la acetilación de H3K14 en los clones no tratados fue mucho más débil.

      HIGO. 1. Reprogramación de la acetilación de H3K9 en embriones clonados. Panel de inyección: (A) H3K9 no fue acetilado en el ovocito MII (B) H3K9 fue acetilado en el núcleo de la célula somática 10 min y (C) 30 min después de SCNT (D) H3K9 fue desacetilado en ovocito SCNT 1 hy (mi) 3 h después de la inyección del núcleo de la célula somática con condensación cromosómica. Panel de clonación: (F) H3K9 permaneció sin acetilar en los embriones clonados 30 min, (GRAMO) 1 h, y (H) 3 h después del tratamiento de activación (I) H3K9 se volvió a acetilar en los embriones clonados 6 h después de la activación (J) La intensidad de acetilación de H3K9 aumentó 10 h después de la activación. Panel Clon + TSA: (K) H3K9 permaneció sin acetilar en los embriones clonados 30 min, (L) 1 h, y (METRO) 3 h después de la activación con TSA (norte) H3K9 se volvió a acetilar en los embriones clonados 6 h después de la activación con TSA (O) La intensidad de acetilación de H3K9 aumentó 10 h después de la activación con TSA y exhibió una intensidad más fuerte que los clones no tratados. Panel ICSI: (PAG) Ambos genomas parentales no mostraron acetilación de H3K9 en embriones producidos por ICSI después de 30 min, (Q) 1 h, y (R) 3 h después de la inyección de cabezas de esperma (S) La acetilación de H3K9 ocurrió en ambos genomas parentales 6 h después de ICSI (T) La intensidad de acetilación de H3K9 aumentó 10 h después de ICSI (A'T ′) Se muestra la tinción del ADN de los mismos ovocitos. Bar = 10 μm.

      HIGO. 2. Reprogramación de la acetilación de H3K14 en embriones clonados. Panel de inyección: (A) H3K14 no se acetila en el ovocito MII (B) H3K14 se acetiló en el núcleo de la célula somática 10 min después de SCNT (C) La acetilación de H3K14 permaneció en los ovocitos reconstruidos 30 min y (D) 1 h después de la inyección con condensación cromosómica (mi) H3K14 se desacetila en ovocitos reconstruidos 3 h después de la inyección del núcleo somático. Panel de clonación: (F) H3K14 permaneció sin acetilar o acetilado débilmente (se usaron ovocitos reconstruidos 1-3 h después de la inyección de núcleos de células somáticas para la activación) en los embriones clonados 30 min, (GRAMO) 1 h, y (H) 3 h después del tratamiento de activación (I) H3K14 se volvió a acetilar en embriones clonados 6 h después de la activación (J) La intensidad de acetilación de H3K14 aumentó en embriones clonados 10 h después de la activación. Panel Clon + TSA: (K) H3K14 permaneció sin acetilar o acetilado débilmente en embriones clonados 30 min y (L) 1 h después de la activación con TSA (METRO) La reacetilación de H3K14 en embriones clonados ocurrió 3 h después de la activación con TSA y el cromosoma aún permanecía condensado (norte) H3K14 fue acetilado en los pseudo-pronúcleos de embriones clonados 6 h después de la activación con tratamiento con TSA (O) La intensidad de H3K14 aumentó en los embriones clonados 10 h después de la activación con el tratamiento con TSA. Panel ICSI: (PAG) H3K14 no fue acetilado en ambos genomas parentales 30 min y (Q) 1 h después de la realización de ICSI (R) La reacetilación de H3K14 ocurrió en ambos genomas parentales 3 h después de ICSI y el ovocito todavía estaba en la etapa de telofase II (S) H3K14 estaba altamente acetilado en ambos pronúcleos parentales 6 hy (T) 10 h después de la realización de ICSI (A'T ′) Se muestra la tinción del ADN de los mismos ovocitos. Bar = 10 μm.

      HIGO. 1. Reprogramación de la acetilación de H3K9 en embriones clonados. Panel de inyección: (A) H3K9 no fue acetilado en el ovocito MII (B) H3K9 fue acetilado en el núcleo de la célula somática 10 min y (C) 30 min después de SCNT (D) H3K9 fue desacetilado en ovocito SCNT 1 hy (mi) 3 h después de la inyección del núcleo de la célula somática con condensación cromosómica. Panel de clonación: (F) H3K9 permaneció sin acetilar en los embriones clonados 30 min, (GRAMO) 1 h, y (H) 3 h después del tratamiento de activación (I) H3K9 se volvió a acetilar en los embriones clonados 6 h después de la activación (J) La intensidad de acetilación de H3K9 aumentó 10 h después de la activación. Panel Clon + TSA: (K) H3K9 permaneció sin acetilar en los embriones clonados 30 min, (L) 1 h, y (METRO) 3 h después de la activación con TSA (norte) H3K9 se volvió a acetilar en los embriones clonados 6 h después de la activación con TSA (O) La intensidad de acetilación de H3K9 aumentó 10 h después de la activación con TSA y exhibió una intensidad más fuerte que los clones no tratados. Panel ICSI: (PAG) Ambos genomas parentales no mostraron acetilación de H3K9 en embriones producidos por ICSI después de 30 min, (Q) 1 h, y (R) 3 h después de la inyección de cabezas de esperma (S) La acetilación de H3K9 ocurrió en ambos genomas parentales 6 h después de ICSI (T) La intensidad de acetilación de H3K9 aumentó 10 h después de ICSI (A'T ′) Se muestra la tinción del ADN de los mismos ovocitos. Bar = 10 μm.

      HIGO. 2. Reprogramación de la acetilación de H3K14 en embriones clonados. Panel de inyección: (A) H3K14 no fue acetilado en el ovocito MII (B) H3K14 se acetiló en el núcleo de la célula somática 10 min después de SCNT (C) La acetilación de H3K14 permaneció en los ovocitos reconstruidos 30 min y (D) 1 h después de la inyección con condensación cromosómica (mi) H3K14 se desacetila en ovocitos reconstruidos 3 h después de la inyección del núcleo somático. Panel de clonación: (F) H3K14 permaneció sin acetilar o acetilado débilmente (se usaron ovocitos reconstruidos 1-3 h después de la inyección de núcleos de células somáticas para la activación) en los embriones clonados 30 min, (GRAMO) 1 h, y (H) 3 h después del tratamiento de activación (I) H3K14 se volvió a acetilar en embriones clonados 6 h después de la activación (J) La intensidad de acetilación de H3K14 aumentó en embriones clonados 10 h después de la activación. Panel Clon + TSA: (K) H3K14 permaneció sin acetilar o acetilado débilmente en embriones clonados 30 min y (L) 1 h después de la activación con TSA (METRO) La reacetilación de H3K14 en embriones clonados ocurrió 3 h después de la activación con TSA y el cromosoma aún permanecía condensado (norte) H3K14 fue acetilado en los pseudo-pronúcleos de embriones clonados 6 h después de la activación con tratamiento con TSA (O) La intensidad de H3K14 aumentó en los embriones clonados 10 h después de la activación con el tratamiento con TSA. Panel ICSI: (PAG) H3K14 no fue acetilado en ambos genomas parentales 30 min y (Q) 1 h después de la realización de ICSI (R) La reacetilación de H3K14 ocurrió en ambos genomas parentales 3 h después de ICSI y el ovocito todavía estaba en la etapa de telofase II (S) H3K14 estaba altamente acetilado en ambos pronúcleos parentales 6 hy (T) 10 h después de la realización de ICSI (A'T ′) Se muestra la tinción del ADN de los mismos ovocitos. Bar = 10 μm.

      Reprogramación dinámica de la acetilación en los residuos de lisina 8, 12 y 16 de la histona H4 en el primer ciclo celular de embriones clonados

      La acetilación de los residuos de lisina 8, 12 y 16 en la histona H4 del núcleo de la célula somática mostró diferencias dramáticas después de la inyección en ovocitos MII enucleados. Como se muestra en las Figuras 3 y 4, tanto la acetilación de H4K8 como la de H4K12 mostraron patrones similares en los ovocitos MII de control y los embriones ICSI. Tanto H4K8 como H4K12 se acetilaron en los cromosomas de los ovocitos MII, y dicha acetilación en el genoma materno se mantuvo en el proceso de fertilización sin que ocurriera desacetilación (Fig. 3A Fig. 3, P – T Fig. 4A Fig. 4, P– T). La acetilación de H4K8 y H4K12 se restauró rápidamente en el genoma paterno tras la sustitución de protaminas por histonas, y la intensidad de acetilación en ambos pronúcleos se distribuyó por igual (Fig. 3, Q – T Fig. 4, Q – T). Sin embargo, la acetilación de H4K12 exhibió una localización dinámica después de la formación de pronúcleos, y se observó una intensa dispersión de la acetilación de H4K12 en la periferia del núcleo (Fig. 4T), lo que concuerda con un informe anterior [21]. De manera similar a los ovocitos de control y los embriones ICSI, la acetilación de H4K8 y H4K12 estuvo presente de manera constante en el núcleo de la célula somática y en los embriones clonados (Fig. 3, F – J Fig. 4, F – J). Sin embargo, la intensidad de acetilación de ambos residuos de lisina en los embriones clonados tratados con TSA fue mucho mayor que en los clones no tratados (Fig. 3, K – O Fig. 4, K – O). Además, la localización de la acetilación de H4K12 observada en el área perinuclear de los clones tratados con TSA se asemejaba a la de los embriones ICSI de control, mientras que los clones no tratados mostraban una distribución igual de acetilación de H4K12 en los pseudo-pronúcleos (Fig. 40 Fig. 4J). El patrón de acetilación de H4K16 en embriones clonados y embriones de control fue similar al patrón de acetilación de H3K9 descrito anteriormente. Como se muestra en la Figura 5, H4K16 no fue acetilado en el ovocito MII, y ambos genomas parentales recuperaron la acetilación 6 h después de ICSI y exhibieron una distribución igual en ambos pronúcleos con fuerte intensidad 10 h después de ICSI (Fig.6A Fig.6, P –T). Por el contrario, H4K16 se acetila en el núcleo de la célula somática y se desacetila después de la inyección del núcleo de la célula somática en el ovocito MII enucleado en 1 h (Fig. 6, B-E). La acetilación de H4K16 se recuperó en el genoma de los embriones clonados después de la activación, similar a la situación en los embriones ICSI, excepto que los clones tratados con TSA se parecían más a los embriones normales con una intensidad de acetilación de H4K16 similar presente en los pronúcleos (panel de clones, Fig.6, Panel F – J Clon + TSA, Fig. 6, K – O).

      HIGO. 3. Reprogramación de la acetilación de H4K8 en embriones clonados. Panel de inyección: (A) H4K8 fue acetilado en ovocito MII (B) H4K8 fue altamente acetilado en ovocitos reconstruidos 10 min y (C) 30 min después de la inyección (D) H4K8 permaneció acetilado en los cromosomas condensados ​​de los ovocitos reconstruidos 1 hy (mi) 3 h después de SCNT. Panel de clonación: (F) La acetilación de H4K8 persistió en los cromosomas condensados ​​de embriones clonados 30 min, (GRAMO) 1 h, y (H) 3 h después de la activación (I) H4K8 permaneció acetilado en los pseudo-pronúcleos de embriones clonados 6 hy (J) 10 h después del tratamiento de activación. Panel Clon + TSA: (K) La acetilación de H4K8 persistió en los cromosomas condensados ​​de embriones clonados 30 min, (L) 1 h, y (METRO) 3 h después de la activación con TSA (norte) H4K8 permaneció acetilado con alta intensidad en los pseudo-pronúcleos de embriones clonados 6 hy (O) 10 h después de la activación con TSA. Panel ICSI: (PAG) H4K8 se acetiló en los cromosomas condensados ​​del ovocito, pero no en el genoma paterno, 30 min después de ICSI (Q) La acetilación de H4K8 ocurrió en ambos genomas parentales 1 hy (R) 3 h después de ICSI (S) H4K8 permaneció acetilado con alta intensidad en ambos pronúcleos parentales 6 hy (T) 10 h después de ICSI (A'T ′) Se muestra la tinción del ADN de los mismos ovocitos. Bar = 10 μm.

      HIGO. 4. Reprogramación de la acetilación de H4K12 en embriones clonados. Panel de inyección: (A) H4K12 se acetiló en ovocito MII (B) H4K12 fue altamente acetilado en ovocitos reconstruidos 10 min y (C) 30 min después de la inyección (D) H4K12 permaneció acetilado en los cromosomas condensados ​​de los ovocitos reconstruidos 1 hy (mi) la intensidad disminuyó 3 h después de SCNT. Panel de clonación: (F) La acetilación de H4K12 persistió en los cromosomas condensados ​​de embriones clonados 30 min, (GRAMO) 1 h, y (H) 3 h después de la activación (I) H4K12 permaneció acetilado en los pseudo-pronúcleos de embriones clonados 6 hy (J) 10 h después del tratamiento de activación. Panel Clon + TSA: (K) La acetilación de H4K12 persistió en los cromosomas condensados ​​de embriones clonados 30 min, (L) 1 h, y (METRO) 3 h después de la activación con tratamiento con TSA (norte) H4K12 permaneció acetilado con alta intensidad en los pseudo-pronúcleos de embriones clonados 6 h después de la activación con el tratamiento con TSA (O) Acetilación de H4K12 localizada principalmente en el área de la periferia nuclear de pseudo-pronúcleos en embriones clonados 10 h después de la activación con tratamiento con TSA. Panel ICSI: (PAG) H4K12 fue acetilado en los cromosomas condensados ​​del ovocito, pero no en el genoma paterno, 30 min después de ICSI (Q) La acetilación de H4K12 ocurrió en ambos genomas parentales 1 h después de ICSI y (R) 3 h después de ICSI (S) H4K12 permaneció acetilado con alta intensidad en ambos pronúcleos parentales 6 h después de ICSI (T) Acetilación de H4K12 localizada principalmente en la periferia nuclear de los pronúcleos parentales 10 h después de ICSI (A'T ′) Se muestra la tinción del ADN de los mismos ovocitos. Bar = 10 μm.

      HIGO. 3. Reprogramación de la acetilación de H4K8 en embriones clonados. Panel de inyección: (A) H4K8 fue acetilado en ovocito MII (B) H4K8 fue altamente acetilado en ovocitos reconstruidos 10 min y (C) 30 min después de la inyección (D) H4K8 permaneció acetilado en los cromosomas condensados ​​de los ovocitos reconstruidos 1 hy (mi) 3 h después de SCNT. Panel de clonación: (F) La acetilación de H4K8 persistió en los cromosomas condensados ​​de embriones clonados 30 min, (GRAMO) 1 h, y (H) 3 h después de la activación (I) H4K8 permaneció acetilado en los pseudo-pronúcleos de embriones clonados 6 hy (J) 10 h después del tratamiento de activación. Panel Clon + TSA: (K) La acetilación de H4K8 persistió en los cromosomas condensados ​​de embriones clonados 30 min, (L) 1 h, y (METRO) 3 h después de la activación con TSA (norte) H4K8 permaneció acetilado con alta intensidad en los pseudo-pronúcleos de embriones clonados 6 hy (O) 10 h después de la activación con TSA. Panel ICSI: (PAG) H4K8 se acetiló en los cromosomas condensados ​​del ovocito, pero no en el genoma paterno, 30 min después de ICSI (Q) La acetilación de H4K8 ocurrió en ambos genomas parentales 1 hy (R) 3 h después de ICSI (S) H4K8 permaneció acetilado con alta intensidad en ambos pronúcleos parentales 6 hy (T) 10 h después de ICSI (A'T ′) Se muestra la tinción del ADN de los mismos ovocitos. Bar = 10 μm.

      HIGO. 4. Reprogramación de la acetilación de H4K12 en embriones clonados. Panel de inyección: (A) H4K12 se acetiló en ovocito MII (B) H4K12 fue altamente acetilado en ovocitos reconstruidos 10 min y (C) 30 min después de la inyección (D) H4K12 permaneció acetilado en los cromosomas condensados ​​de los ovocitos reconstruidos 1 hy (mi) la intensidad disminuyó 3 h después de SCNT. Panel de clonación: (F) La acetilación de H4K12 persistió en los cromosomas condensados ​​de embriones clonados 30 min, (GRAMO) 1 h, y (H) 3 h después de la activación (I) H4K12 permaneció acetilado en los pseudo-pronúcleos de embriones clonados 6 hy (J) 10 h después del tratamiento de activación. Panel Clon + TSA: (K) La acetilación de H4K12 persistió en los cromosomas condensados ​​de embriones clonados 30 min, (L) 1 h, y (METRO) 3 h después de la activación con tratamiento con TSA (norte) H4K12 permaneció acetilado con alta intensidad en los pseudo-pronúcleos de embriones clonados 6 h después de la activación con el tratamiento con TSA (O) Acetilación de H4K12 localizada principalmente en el área de la periferia nuclear de pseudo-pronúcleos en embriones clonados 10 h después de la activación con tratamiento con TSA. Panel ICSI: (PAG) H4K12 fue acetilado en los cromosomas condensados ​​del ovocito, pero no en el genoma paterno, 30 min después de ICSI (Q) La acetilación de H4K12 ocurrió en ambos genomas parentales 1 h después de ICSI y (R) 3 h después de ICSI (S) H4K12 permaneció acetilado con alta intensidad en ambos pronúcleos parentales 6 h después de ICSI (T) Acetilación de H4K12 localizada principalmente en la periferia nuclear de los pronúcleos parentales 10 h después de ICSI (A'T ′) Se muestra la tinción del ADN de los mismos ovocitos. Bar = 10 μm.

      HIGO. 5. Reprogramación de la acetilación de H4K16 en embriones clonados. Panel de inyección: (A) H4K16 no se acetila en el ovocito MII (B) H4K16 se acetiló en el núcleo de la célula somática 10 min y (C) 30 min después de SCNT (D) H4K16 fue desacetilado en ovocito SCNT 1 hy (mi) 3 h después de la inyección del núcleo de células somáticas con condensación cromosómica. Panel de clonación: (F) H4K16 permaneció sin acetilar en los cromosomas condensados ​​de embriones clonados 30 min, (GRAMO) 1 h, y (H) 3 h después del tratamiento de activación (I) H4K16 permaneció sin acetilar en los pseudo-pronúcleos de embriones clonados 6 h después de la activación (J) La acetilación de H4K16 se produjo en los pseudo-pronúcleos de embriones clonados 10 h después de la activación. Panel Clon + TSA: (K) H4K16 permaneció sin acetilar en los embriones clonados 30 min, (L) 1 h, y (METRO) 3 h después de la activación con TSA (norte) H4K16 permaneció sin acetilar en los pseudo-pronúcleos de embriones clonados 6 h después de la activación con TSA (O) La acetilación de H4K16 ocurrió en los pseudo-pronúcleos con alta intensidad en embriones clonados 10 h después de la activación con TSA. Panel ICSI: (PAG) Ambos genomas parentales no mostraron acetilación de H4K16 en embriones producidos por ICSI 30 min, (Q) 1 h, y (R) 3 h después de la inyección de cabezas de esperma (S) La acetilación de H4K16 ocurrió en ambos genomas parentales 6 h después de ICSI (T) La intensidad de acetilación de H4K16 aumentó 10 h después de ICSI (A'T ′) Se muestra la tinción del ADN de los mismos ovocitos. Bar = 10 μm.

      HIGO. 6. Reprogramación de la trimetilación de H3K9 en embriones clonados. Panel de inyección: (A) H3K9 fue trimetilado en ovocito MII (B) H3K9 se trimetila en el núcleo de la célula somática 10 min y (C) 30 min después de SCNT (D) H3K9 permaneció trimetilado en los cromosomas condensados ​​del ovocito reconstruido 1 hy (mi) 3 h después de SCNT. Panel de clonación: (F) La trimetilación de H3K9 persistió en los cromosomas condensados ​​de embriones clonados 30 min, (GRAMO) 1 h, y (H) 3 h después del tratamiento de activación (I) La desmetilación de la trimetilación de H3K9 ocurrió en los pseudo-pronúcleos de embriones clonados 6 h después de la activación y (J) la intensidad disminuyó a un nivel muy bajo 10 h después de la activación. Panel Clonar + TSA (K) La trimetilación de H3K9 persistió en los cromosomas condensados ​​de embriones clonados 30 min, (L) 1 h, y (METRO) 3 h después de la activación tratado con TSA (norte) La desmetilación de la trimetilación de H3K9 ocurrió en los pseudo-pronúcleos de embriones clonados 6 h después de la activación tratados con TSA y (O) la intensidad disminuyó a un nivel muy bajo 10 h después de la activación con TSA. Panel ICSI: (PAG) La trimetilación de H3K9 persistió en los cromosomas condensados ​​del ovocito pero no en el genoma paterno 30 min, (Q) 1 h, y (R) 3 h después de ICSI (S) H3K9 permaneció trimetilado en el pronúcleo materno mientras que H3K9 permaneció sin trimetilar en el pronúcleo paterno 6 hy (T) 10 después de ICSI (A'T ′) Se muestra la tinción del ADN de los mismos ovocitos. Bar = 10 μm.

      HIGO. 5. Reprogramación de la acetilación de H4K16 en embriones clonados. Panel de inyección: (A) H4K16 no se acetila en el ovocito MII (B) H4K16 se acetiló en el núcleo de la célula somática 10 min y (C) 30 min después de SCNT (D) H4K16 fue desacetilado en ovocito SCNT 1 hy (mi) 3 h después de la inyección del núcleo de células somáticas con condensación cromosómica. Panel de clonación: (F) H4K16 permaneció sin acetilar en los cromosomas condensados ​​de embriones clonados 30 min, (GRAMO) 1 h, y (H) 3 h después del tratamiento de activación (I) H4K16 permaneció sin acetilar en los pseudo-pronúcleos de embriones clonados 6 h después de la activación (J) La acetilación de H4K16 se produjo en los pseudo-pronúcleos de embriones clonados 10 h después de la activación. Panel Clon + TSA: (K) H4K16 permaneció sin acetilar en los embriones clonados 30 min, (L) 1 h, y (METRO) 3 h después de la activación con TSA (norte) H4K16 permaneció sin acetilar en los pseudo-pronúcleos de embriones clonados 6 h después de la activación con TSA (O) La acetilación de H4K16 ocurrió en los pseudo-pronúcleos con alta intensidad en embriones clonados 10 h después de la activación con TSA. Panel ICSI: (PAG) Ambos genomas parentales no mostraron acetilación de H4K16 en embriones producidos por ICSI 30 min, (Q) 1 h, y (R) 3 h después de la inyección de cabezas de esperma (S) La acetilación de H4K16 ocurrió en ambos genomas parentales 6 h después de ICSI (T) La intensidad de acetilación de H4K16 aumentó 10 h después de ICSI (A'T ′) Se muestra la tinción del ADN de los mismos ovocitos. Bar = 10 μm.

      HIGO. 6. Reprogramación de la trimetilación de H3K9 en embriones clonados. Panel de inyección: (A) H3K9 fue trimetilado en ovocito MII (B) H3K9 se trimetila en el núcleo de la célula somática 10 min y (C) 30 min después de SCNT (D) H3K9 permaneció trimetilado en los cromosomas condensados ​​del ovocito reconstruido 1 hy (mi) 3 h después de SCNT. Panel de clonación: (F) La trimetilación de H3K9 persistió en los cromosomas condensados ​​de embriones clonados 30 min, (GRAMO) 1 h, y (H) 3 h después del tratamiento de activación (I) La desmetilación de la trimetilación de H3K9 ocurrió en los pseudo-pronúcleos de embriones clonados 6 h después de la activación y (J) la intensidad disminuyó a un nivel muy bajo 10 h después de la activación. Panel Clonar + TSA (K) La trimetilación de H3K9 persistió en los cromosomas condensados ​​de embriones clonados 30 min, (L) 1 h, y (METRO) 3 h después de la activación tratado con TSA (norte) La desmetilación de la trimetilación de H3K9 ocurrió en los pseudo-pronúcleos de embriones clonados 6 h después de la activación tratados con TSA y (O) la intensidad disminuyó a un nivel muy bajo 10 h después de la activación con TSA. Panel ICSI: (PAG) La trimetilación de H3K9 persistió en los cromosomas condensados ​​del ovocito pero no en el genoma paterno 30 min, (Q) 1 h, y (R) 3 h después de ICSI (S) H3K9 permaneció trimetilado en el pronúcleo materno mientras que H3K9 permaneció sin trimetilar en el pronúcleo paterno 6 hy (T) 10 después de ICSI (A'T ′) Se muestra la tinción del ADN de los mismos ovocitos. Bar = 10 μm.

      Reprogramación dinámica de tri y dimetilación de histona H3K9 en embriones clonados

      Como se muestra en la Figura 6, la trimetilación de H3K9 en el genoma materno se observó en el ovocito MII y se distribuyó asimétricamente en los genomas parentales después de la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (Fig. 6A Fig. 6, P – T). El genoma materno exhibió trimetilación de H3K9 mientras que el genoma paterno nunca desarrolló tales marcas de trimetilación en H3K9 incluso después de que ocurriera la descondensación cromosómica. En comparación con los ovocitos MII de control y los embriones ICSI, la trimetilación de H3K9 mostró ligeras diferencias en los ovocitos reconstruidos con SCNT y los embriones clonados. La trimetilación de H3K9 estaba presente en el núcleo de las células somáticas y no disminuyó después de la inyección (Fig. 6, B-E). Después de la activación y formación de pseudo-pronúcleos, las marcas de trimetilación de H3K9 se eliminaron gradualmente y no se observó distribución asimétrica en los dos (o más) pseudo-pronúcleos (Fig. 6, F – J). Además, el tratamiento con TSA no mostró ningún efecto sobre la distribución y desaparición de la trimetilación de H3K9 en embriones clonados (Fig. 6, K – O). De manera similar al patrón de trimetilación de H3K9 observado en embriones de control y clonados, la dimetilación de H3K9 se distribuyó asimétricamente en los genomas parentales de los embriones producidos con ICSI y se distribuyó por igual en los genomas de los embriones clonados. Como se muestra en la Figura 7, se observó dimetilación de H3K9 en el genoma de los ovocitos MII y se distribuyó asimétricamente en los genomas parentales después de ICSI (Fig. 7A Fig. 7, P – T). No se detectó dimetilación de H3K9 en el genoma paterno y las marcas de dimetilación persistieron en el genoma materno hasta 6 h después de ICSI (Fig. 7S). La desaparición de las marcas de dimetilación de H3K9 en el genoma materno ocurrió 10 h después de ICSI, y ambos pronúcleos no mostraron marcas de dimetilación de H3K9 (Fig. 7T). Se pudo observar dimetilación de H3K9 en el núcleo de la célula somática después de SCNT, y la intensidad de la dimetilación disminuyó junto con la condensación cromosómica (Fig. 7, B – E). Las marcas de dimetilación persistieron en los embriones clonados después de la activación y desaparecieron 10 h después del tratamiento de activación (Fig. 7, F – J). Tanto los embriones clonados tratados con TSA como los no tratados no mostraron diferencias en la persistencia y desaparición de las marcas de dimetilación de H3K9 (Fig. 7, K – O).

      Reprogramación de la dimetilación de H3K9 en embriones clonados. Panel de inyección: (A) H3K9 se dimetila en ovocito MII (B) H3K9 se dimetila en el núcleo de la célula somática 10 min y (C) 30 min después de SCNT (D) H3K9 permaneció dimetilado con una destilación leve que ocurre en los cromosomas condensados ​​del ovocito reconstruido 1 hy (mi) 3 h después de SCNT. Panel de clonación: (F) La dimetilación de H3K9 persistió en los cromosomas condensados ​​de embriones clonados 30 min, (GRAMO) 1 h, y (H) 3 h después del tratamiento de activación (I) La desmetilación de la dimetilación de H3K9 ocurrió en los pseudo-pronúcleos de embriones clonados 6 h después de la activación y (J) la intensidad disminuyó a un nivel muy bajo 10 h después de la activación. Panel Clon + TSA: (K) La dimetilación de H3K9 persistió en los cromosomas condensados ​​de embriones clonados durante 30 min, L) 1 h, y METRO) 3 h después de la activación con TSA (norte) La desmetilación de la dimetilación de H3K9 ocurrió en los pseudo-pronúcleos de embriones clonados 6 h después de la activación con TSA y (O) la intensidad de la dimetilación disminuyó a un nivel muy bajo 10 h después de la activación con TSA. Panel ICSI: (PAG) La dimetilación de H3K9 persistió en los cromosomas condensados ​​del ovocito pero no en el genoma paterno 30 min, (Q) 1 h, y (R) 3 h después de ICSI (S) H3K9 permaneció dimetilado en el pronúcleo materno mientras que H3K9 permaneció sin dimetilar en el pronúcleo paterno 6 h después de ICSI (T) La desmetilación de la dimetilación de H3K9 ocurrió en el pronúcleo materno 10 h después de ICSI (A'T ′) Se muestra la tinción del ADN de los mismos ovocitos. Bar = 10 μm.

      Reprogramación de la dimetilación de H3K9 en embriones clonados. Panel de inyección: (A) H3K9 se dimetila en ovocito MII (B) H3K9 se dimetila en el núcleo de la célula somática 10 min y (C) 30 min después de SCNT (D) H3K9 permaneció dimetilado con una destilación leve que ocurre en los cromosomas condensados ​​del ovocito reconstruido 1 hy (mi) 3 h después de SCNT. Panel de clonación: (F) La dimetilación de H3K9 persistió en los cromosomas condensados ​​de embriones clonados 30 min, (GRAMO) 1 h, y (H) 3 h después del tratamiento de activación (I) La desmetilación de la dimetilación de H3K9 ocurrió en los pseudo-pronúcleos de embriones clonados 6 h después de la activación y (J) la intensidad disminuyó a un nivel muy bajo 10 h después de la activación. Panel Clon + TSA: (K) La dimetilación de H3K9 persistió en los cromosomas condensados ​​de embriones clonados durante 30 min, L) 1 h, y METRO) 3 h después de la activación con TSA (norte) La desmetilación de la dimetilación de H3K9 ocurrió en los pseudo-pronúcleos de embriones clonados 6 h después de la activación con TSA y (O) la intensidad de la dimetilación disminuyó a un nivel muy bajo 10 h después de la activación con TSA. Panel ICSI: (PAG) La dimetilación de H3K9 persistió en los cromosomas condensados ​​del ovocito pero no en el genoma paterno 30 min, (Q) 1 h, y (R) 3 h después de ICSI (S) H3K9 permaneció dimetilado en el pronúcleo materno mientras que H3K9 permaneció sin dimetilar en el pronúcleo paterno 6 h después de ICSI (T) La desmetilación de la dimetilación de H3K9 ocurrió en el pronúcleo materno 10 h después de ICSI (A'T ′) Se muestra la tinción del ADN de los mismos ovocitos. Bar = 10 μm.


      Modificaciones de histonas

      La representación esquemática muestra la organización y empaquetado del material genético. Los nucleosomas están representados por ADN (gris) envuelto alrededor de ocho proteínas histonas, H2A, H2B, H3 y H4 (círculos de colores). Las colas de histonas N-terminales (azules) se muestran sobresaliendo de H3 y H4.

      A modificación de histonas es una modificación postraduccional covalente (PTM) de las proteínas histonas que incluye metilación, fosforilación, acetilación, ubiquitilación y sumoilación. Los PTM hechos a las histonas pueden afectar la expresión génica alterando la estructura de la cromatina o reclutando modificadores de histonas. Las proteínas histonas actúan para empaquetar el ADN, que envuelve las ocho histonas, en cromosomas. Las modificaciones de histonas actúan en diversos procesos biológicos como la activación / inactivación de la transcripción, el empaquetamiento de cromosomas y el daño / reparación del ADN. En la mayoría de las especies, la histona H3 se acetila principalmente en las lisinas 9, 14, 18, 23 y 56, se metila en la arginina 2 y las lisinas 4, 9, 27, 36 y 79 y se fosforila en ser10, ser28, Thr3 y Thr11. . La histona H4 se acetila principalmente en las lisinas 5, 8, 12 y 16, se metila en la arginina 3 y la lisina 20 y se fosforila en la serina 1. Por lo tanto, la detección cuantitativa de varias modificaciones de histonas proporcionaría información útil para comprender mejor la regulación epigenética de las células procesos y el desarrollo de fármacos dirigidos a enzimas modificadoras de histonas.

      Acetilación / desacetilación de histonas

      La acetilación de histonas se produce por la adición enzimática de un grupo acetilo (COCH3) de la acetil coenzima A. El proceso de acetilación de histonas está estrechamente involucrado en la regulación de muchos procesos celulares, incluida la dinámica y transcripción de la cromatina, el silenciamiento de genes, la progresión del ciclo celular, la apoptosis, la diferenciación, la replicación del ADN, la reparación del ADN, la importación nuclear y la represión neuronal . Las enzimas modificadoras implicadas en la acetilación de histonas se denominan acetiltransferasas de histonas (HAT) y desempeñan un papel fundamental en el control de la acetilación de histonas H3 y H4. Se han identificado más de 20 HAT que se pueden clasificar en cinco familias: GNAT1, MYST, TAFII250, P300 / CBP y coactivadores de receptores nucleares como ACTR. 1 La acetilación de la histona H3 puede aumentar mediante la inhibición de las histonas desacetilasas (HDAC) y disminuir mediante la inhibición de HAT.

      Los desacetilatos de histona (HDAC) catalizan la eliminación hidrolítica de grupos acetilo de los residuos de histona lisina. Un desequilibrio en el equilibrio de la acetilación de histonas se ha asociado con la tumorigénesis y la progresión del cáncer. Detectar si la histona H3 está acetilada en sus residuos de lisina proporcionaría información útil para una caracterización adicional de los patrones o sitios de acetilación, lo que conduciría a una mejor comprensión de la regulación epigenética de la activación génica, así como al desarrollo de fármacos dirigidos a HAT. Al igual que los HAT, las HDAC desempeñan un papel fundamental en varios procesos celulares que involucran a las histonas H3 y H4. Hasta ahora, se han identificado al menos 4 clases de HDAC. Las HDAC de clase I incluyen 1, 2, 3 y 8. Las HDAC de clase II se componen de 4, 5, 6, 7, 9 y 10. Las enzimas de clase III, conocidas como sirtuinas, requieren cofactores NAD + e incluyen SIRT 1-7. La enzima de Clase IV, que contiene solo HDAC11, tiene características de Clase I y II. La inhibición de HDAC muestra efectos significativos sobre la apoptosis, la detención del ciclo celular y la diferenciación en las células cancerosas. Los inhibidores de HDAC se están desarrollando actualmente como agentes contra el cáncer. 2

      Metilación / desmetilación de histonas

      La metilación de histonas se define como la transferencia de uno, dos o tres grupos metilo de S-adenosil-L-metionina a residuos de lisina o arginina de proteínas histonas por las histonas metiltransferasas (HMT). Los HMT controlan o regulan la metilación del ADN a través de la represión o activación transcripcional dependiente de cromatina. En el núcleo de la célula, cuando se produce la metilación de histonas, se pueden activar o silenciar genes específicos dentro del ADN complejado con la histona. 3 Existen varias histonas metiltransferasas diferentes que son específicas del residuo de lisina o arginina que modifican. En la histona H3, por ejemplo, SET1, SET7 / 9, Ash1, ALL-1, MLL, ALR, Trx y SMYD3 son histonas metiltransferasas que catalizan la metilación de la histona H3 en la lisina 4 (H3-K4) en células de mamíferos. ESET, G9a, SUV39-h1, SUV39-h2, SETDB1, Dim-5 y Eu-HMTasa son histonas metiltransferasas que catalizan la metilación de la histona H3 en la lisina 9 (H3-K9) en células de mamíferos. Las enzimas del grupo G9a y polycomb como EZH2 son metiltransferasas de histonas que catalizan la metilación de la histona H3 en la lisina 27 (H3-K27) en células de mamíferos. 4 La metilación de H3-K9 y H3-K27 media la formación de heterocromatina y también participa en el silenciamiento de la expresión génica en sitios eucromáticos. También se ha encontrado que el aumento de la metilación global de H3-K27 está involucrado en algunos procesos patológicos como la progresión del cáncer.


      Ver el vídeo: Metilación del ADN (Mayo 2022).


Comentarios:

  1. Gaagii

    tema útil

  2. Maclachlan

    Un buen argumento

  3. Zolojin

    Bravo, tu pensamiento es genial.

  4. Vik

    Lo siento, eso ha interferido... A mí una situación similar. Vamos a discutir. Escribe aquí o en PM.

  5. Tearly

    Lo siento, pero creo que estás cometiendo un error. Discutamos esto. Envíeme un correo electrónico a PM, hablaremos.



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