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15.4: Activación e inactivación del complejo ciclina-cdk - Biología

15.4: Activación e inactivación del complejo ciclina-cdk - Biología


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A medida que se examinaban más levaduras mutantes para detectar cambios en su ciclo celular, se encontraron otros dos genes en los que las mutaciones dieron lugar a fenotipos similares. Actuando junto con una enzima más, CAK (quinasa activadora de cdk), activan la cdk (Figura ( PageIndex {3} )).

Usando el complejo mitótico ciclina / cdk como ejemplo, la ciclina (cdc13) y cdk (cdc2) se unen para formar un complejo inactivo. Luego, la cdk es fosforilada por wee1, una quinasa. El fosfato que pone en la tirosina-15 es necesario para el resto de la secuencia de activación, pero es inhibitorio: en realidad previene activación final. Pero una vez que se fosforila Tyr-15, CAK puede fosforilar una treonina vecina (Thr-161), que es necesaria para la activación. Finalmente, cdc25, una proteína fosfatasa, elimina el fosfato en Tyr-15, permitiendo la activación de cdk por el Thr-161 fosforilado, y el MPF finalmente está en camino. También hay una autoamplificación de la activación, porque uno de los objetivos de MPF es cdc25, por lo que hay un bucle de retroalimentación positiva en el que la actividad de cdc25 se regula al alza por fosforilación.

Como verá en una sección posterior de este capítulo, MPF realiza muchas funciones, algunas de las cuales previenen el progreso de la mitosis después de la anafase. Por lo tanto, debe haber una forma de apagar MPF (y para el caso, cualquier complejo ciclina / cdk) rápida y completamente cuando la célula alcanza la etapa apropiada del ciclo celular. Esto se ve confirmado por estudios de curso temporal de la actividad de MPF, que muestran una caída precipitada de la actividad en anafase. Esto coincide con un agotamiento de la ciclina B (cdc13 en S. pombe) debido a una combinación de desactivación de la transcripción del gen y degradación proteolítica específica. La vía de degradación ahora se comprende bien y es un ejemplo interesante de una especie de regulación por retroalimentación.

Esencialmente, MPF asegura su propia destrucción: uno de sus objetivos de fosforilación es cdc20. Tras la fosforilación, cdc20 se activa y luego activa el complejo promotor de anafase (APC). APC es una ubiquitina ligasa (tipo E3) que poliubiquitina la ciclina del complejo MPF, convirtiéndola en un objetivo para la degradación proteolítica por parte de un proteosoma. Tenga en cuenta que solo se destruye la ciclina, mientras que la quinasa se deja sola. Sin la ciclina, la quinasa está inactiva y debe esperar a que los niveles de ciclina aumenten nuevamente antes de que pueda reactivarse mediante una nueva ronda de fosforilación y desfosforilación.


15.4: Activación e inactivación del complejo ciclina-cdk - Biología

Las proteínas inhibidoras de la quinasa dependiente de ciclina (Cdk) están involucradas en la detención del ciclo celular inducida por factores o sustancias químicas antiproliferantes. La alta densidad celular también induce la detención del ciclo celular en el que el ADN genómico no se replica, incluso en presencia de una dosis mitótica de factores de crecimiento, esto se denomina inhibición por contacto. Aunque el ciclo celular de la línea celular de fibroblastos de rata, 3Y1, se detuvo en reposo por inhibición por contacto, el Cdk4 se unió a su subunidad reguladora, ciclina D1 o D3. Sin embargo, estos complejos fueron enzimáticamente inactivos. La fosforilación de la Cdk4 unida a ciclina D1 por la quinasa activadora de Cdk podría convertir el complejo inactivo ciclina D1-Cdk4 en su forma activa in vitro, lo que sugiere que la treonina 172 de la Cdk4, cuya fosforilación es necesaria para su activación, no estaba fosforilada en parte en las células 3Y1 inhibidas por contacto. Aunque MO15 era activo en extractos celulares preparados a partir de las células 3Y1 detenidas, se inhibió la activación de Cdk4 producida bacterianamente en los extractos celulares. Eliminación de p27 kip1 de los extractos celulares permitió que la holoenzima MO15 fosforilara la Cdk4 y, a su vez, la activara, lo que indica que p27 kip1 juega un papel en la inhibición de la fosforilación de Cdk4 por MO15 en las células 3Y1 inhibidas por contacto.


Biología celular funcional

Entrada no programada a la mitosis

La quinasa dependiente de ciclina 1 (CDK1) es la principal proteína quinasa que conduce a las células a la mitosis normal. CDK1 se activa al unirse a ciclinas de tipo B (principalmente ciclina B1), que luego fosforila los sustratos críticos para la entrada en la mitosis. La destrucción de ciclina B1 proporciona un mecanismo para inactivar rápidamente CDK1 y permitir que la célula salga de la mitosis (Fung y Poon, 2005).

CDK1 está presente durante todo el ciclo celular. Por el contrario, la ciclina B1 se acumula y forma un complejo con CDK1 después de entrar en la fase S. El complejo se mantiene inactivo antes de la mitosis por MYT1 y WEE1 a través de la fosforilación de CDK1 Thr14 / Tyr15. Al final de G2 fase, la reserva de ciclina B1-CDK1 inactiva es activada abruptamente por miembros de la familia de fosfatasa CDC25. La ciclina B1-CDK1 cataliza su propia activación al estimular simultáneamente la activación de CDC25 y la inactivación de WEE1 (Lindqvist et al., 2009). Se cree que este sistema biestable es impulsado por PLK1, iniciando la activación de CDC25 y la inactivación de WEE1 / MYT1 (van Vugt y Medema, 2005). La activación de PLK1 a su vez requiere la fosforilación de PLK1 Thr210 por Aurora A, un evento que es asistido por Bora. La unión de Bora a PLK1 es estimulada por la fosforilación dependiente de ciclina B1-CDK1, creando otro ciclo de retroalimentación positiva en la activación de CDK1 (Lindqvist et al., 2009 ).

Para mantener la estabilidad del genoma, es vital prevenir la entrada mitótica antes de que se complete la replicación o reparación del ADN. Varios puestos de control participan en el seguimiento de la integridad del ADN y previenen la entrada precoz en la mitosis. Ahora está claro que estos puntos de control están involucrados en principios subyacentes similares para prevenir la activación de CDK1 (Kastan y Bartek, 2004).

Después de la exposición a radiación ionizante u otras agresiones genotóxicas que provocan roturas de la doble hebra del ADN, la ATM se autofosforila en Ser1981, lo que conduce a la liberación de monómeros activos de los complejos homodímeros. La quinasa ATR relacionada con ATM se activa mediante un espectro más amplio de estrés que incluye hipoxia y estrés de replicación. A continuación, ATM / ATR fosforila los residuos en el dominio SQ / TQ de CHK1 / CHK2, estimulando así la actividad de estas quinasas efectoras (Smith et al., 2010 ).

Las horquillas de replicación estancadas, que pueden ser inducidas por un suministro insuficiente de nucleótidos o por lesiones y obstáculos en el ADN, activan principalmente la vía ATR-CHK1. Esta vía es esencial incluso en ausencia de estrés exógeno durante la fase S no perturbada, probablemente para mantener altas tasas de progresión de la horquilla de replicación (Petermann y Caldecott, 2006).

Una vez que se activa la cascada ATM / ATR – CHK1 / CHK2, la actividad de CDK1 se suprime mediante la fosforilación inhibidora (Chen y Poon, 2008). CHK1 fosforila y activa WEE1 al promover la unión de 14-3-3. Además, CHK1 / CHK2 también reprime las tres isoformas de la familia de fosfatasa CDC25. Específicamente, la fosforilación de CDC25C por CHK1 / CHK2 inactiva su actividad fosfatasa tanto directa como indirectamente a través de la creación de un sitio de unión 14-3-3. La unión de 14-3-3 enmascara una secuencia de localización nuclear proximal y ancla CDC25C en el citoplasma, evitando el acceso eficiente de CDC25C a su sustrato ciclina B1 – CDK1. CDC25B, que posee un papel único en la activación de ciclina B1-CDK1 en el centrosoma, también se inactiva mediante la unión de 14-3-3 después de la fosforilación dependiente de CHK1. Finalmente, CDC25A está dirigido a una degradación rápida por ubiquitinación dependiente de β-TrCP de SCF después de fosforilación dependiente de CHK1. En conjunto, estos mecanismos suprimen la actividad de CDK1 cuando no se completa la replicación o reparación del ADN.

Se prevé que la mitosis inoportuna de distintos períodos del ciclo celular puede ejercer diferentes efectos sobre la catástrofe mitótica. Mientras que G normal1 Las células probablemente contienen complejos de ciclina B1-CDK1 insuficientes para soportar la mitosis precoz, las células en la fase S comienzan a acumular ciclina B1. Estimular la mitosis en células con ADN incompletamente replicado debería generar defectos extensos en la segregación cromosómica. De manera similar, la presencia de daño en el ADN no reparado debería afectar profundamente a la mitosis. Conceptualmente, es menos claro si la catástrofe mitótica es inducida por la aceleración de G2 células en mitosis.

El desacoplamiento de los puntos de control de la integridad del ADN promueve la entrada no programada en la mitosis. Se ha vuelto cada vez más claro que la catástrofe mitótica es un resultado importante de la mitosis no programada (Chan et al., 1999 Castedo et al., 2004 Vogel et al., 2007). Las células que poseen puntos de control defectuosos, como las derivadas de la ataxia-telangiectasia, a menudo exhiben síntesis de ADN radio-resistente y catástrofe mitótica (Lavin y Khanna, 1999). Dado que el efecto final de los puntos de control es una acumulación de fosforilación inhibidora de CDK1, no es sorprendente que la expresión de un mutante no fosforilable de CDK1 también pueda desencadenar una catástrofe mitótica (Blasina et al., 1997 Niida et al., 2005 Chow et al., 2003 ).

Los agentes que se dirigen a componentes del eje ATM / ATR – CHK1 / CHK2 pueden inducir una catástrofe mitótica. De hecho, varios de estos inhibidores de moléculas pequeñas son agentes anticancerosos prometedores (Furgason y Bahassi el, 2013). El punto de control de ensamblaje del huso es necesario para la catástrofe mitótica inducida por la anulación de los puntos de control de integridad del ADN (en et al., 2011 Nitta et al., 2004 Vogel et al., 2004 Chen et al., 2012), sugiriendo que una trampa en la mitosis es indispensable para este tipo de muerte celular.


Reparación de ADN

Kaoru Sugasawa, en Las enzimas, 2019

4.1 Factores involucrados en la verificación de lesiones

4.1.1 TFIIH

TFIIH, un gran complejo de proteínas que consta de 10 subunidades, se divide funcionalmente en dos subcomplejos (Tabla 1) [99]: el núcleo de siete subunidades, que contiene tres productos génicos relacionados con la enfermedad, XPB (ERCC3), XPD (ERCC2) y TTDA (GTF2H5) [100-102] y el módulo de quinasa activadora de CDK (CAK), compuesto por CDK7, ciclina H y MAT1 [103,104]. TFIIH es esencial tanto para la transcripción general como para la NER, y 3 de las 10 subunidades están asociadas con actividades enzimáticas: las actividades de ATPasa / helicasa dependientes de ADN de XPB y XPD, y la actividad de proteína quinasa de CDK7. La caracterización bioquímica temprana reveló que la helicasa XPB puede moverse en una hebra de ADN en la dirección 3′-5 ′, mientras que la helicasa XPD tiene la polaridad opuesta, 5′-3 ′ [101,105]. Aunque estas actividades están implicadas en el desenrollamiento del dúplex de ADN en el promotor (para la transcripción) así como en el sitio de la lesión (para NER), la actividad helicasa de XPB es mucho más débil que la de XPD. Los análisis mutacionales junto con los ensayos bioquímicos indicaron que la actividad helicasa, pero no ATPasa, de XPB es prescindible para NER [106]. Por el contrario, la XPD ATPasa / helicasa no es esencial para la transcripción, pero es necesaria para NER [107,108]. Por otro lado, CAK en TFIIH fosforila el dominio C-terminal de la ARN polimerasa II y, por lo tanto, juega un papel crucial en el inicio de la transcripción [109,110], mientras que CAK por sí mismo también participa en la regulación del ciclo celular activando la ciclina dependiente familia de quinasas (CDK) [111]. En NER, sin embargo, la asociación con CAK tiene un efecto inhibidor sobre la función TFIIH, y CAK se libera del núcleo TFIIH durante el proceso de reparación [112,113].

Tabla 1 . Subunidades del TFIIH humano.

SubunidadGeneNúmero de aminoácidos a Función proteica
Centro
XPB (pág. 89)ERCC3782 (89.3)ATPasa / helicasa dependiente de ADN (3′ – 5 ′)
Translocasas de ADN bicatenario (5′ – 3 ′)
Apertura de sitios de lesión.
Interacción con XPC
XPD (pág. 80)ERCC2760 (86.9)ATPasa / helicasa dependiente de ADN (5′ – 3 ′)
Apertura de sitios de lesión.
Verificación de lesiones
p62GTF2H1548 (62.0)Interacción con XPC
p52GTF2H4462 (52.2)Estimulación de la actividad ATPasa de XPB
p44GTF2H2395 (44.4)Dedo anular
Estimulación de las actividades de ATPasa / helicasa de XPD
p34GTF2H3308 (34.4)Dedo de zinc
TTDA (pág. 8)GTF2H571 (8.1)Estabilización del complejo TFIIH
Quinasa activadora de CDK (CAK)
CDK7CDK7346 (39.0)Proteína quinasa
Fosforilación de CDK, ARN polimerasa II CTD
Ciclina HCCNH323 (37.6)Regulación de la actividad de la proteína quinasa de CDK7
MAT1MNAT1309 (35.8)Dedo anular
Montaje del complejo CAK

Los análisis de partículas individuales mediante microscopía crioelectrónica revelaron que el núcleo TFIIH adopta una estructura en forma de herradura en la que XPB y XPD se colocan en los extremos abiertos y las otras cinco subunidades se alinean a lo largo del arco [114,115]. En presencia de CAK, XPB y XPD están conectados a través de la hélice α larga de MAT1, formando así una conformación en forma de anillo más rígida, que puede restringir sus funciones ATPasa / helicasa (ver más abajo). Cabe señalar que la pérdida total de la subunidad XPB o XPD es incompatible con la viabilidad, incluso a nivel celular, debido al defecto transcripcional resultante. Por lo tanto, a diferencia del grupo C de complementación de XP, los pacientes del grupo B o D de XP expresan un nivel considerable de proteína mutante que alberga la correspondiente sustitución o alteración de aminoácidos de la parte C-terminal [116,117]. De las subunidades no enzimáticas del núcleo TFIIH, p52 y p44 interactúan con XPB y XPD, respectivamente, y modulan sus actividades ATPasa / helicasa [106]. Además, p62 interactúa directamente con la cadena ácida de XPC a través de su dominio de homología Pleckstrin [118,119] y, probablemente junto con XPB [19,38,120], participa en el reclutamiento de TFIIH a los sitios de lesión. TTDA, también llamado p8, es único en que la asociación de esta pequeña proteína con el núcleo TFIIH aumenta sustancialmente la actividad NER, pero es prescindible para in vitro transcripción [121,122]. Al igual que en los pacientes con TTD que albergan mutaciones en XPB o XPD, sin embargo, las variaciones patogénicas de TTDA desestabilizan el complejo TFIIH, disminuyendo así la capacidad transcripcional global de la célula [102,123].

4.1.2 XPA

El humano XPA El gen, que se asigna al cromosoma 9 (9q22.33), consta de seis exones que codifican una proteína de 31 kDa de 273 aminoácidos [124]. Los ortólogos son omnipresentes en eucariotas, desde la levadura hasta los humanos. Aunque XPA no existe como un complejo estrecho con otras proteínas en vivo [125], interactúa con varios factores NER a pesar de su tamaño relativamente pequeño. Sus socios informados incluyen XPC [36], TFIIH [126,127], proteína de replicación A (RPA) [128,129], ERCC1 – XPF [130] y UV-DDB [131], lo que sugiere que XPA coordina el ensamblaje secuencial de los factores NER en la lesión sitios depositando cada componente de manera adecuada. Ambos en vivo y in vitro los estudios apoyan un modelo en el que XPA llega a los sitios de lesión después de XPC y TFIIH [10,11].

La propia proteína XPA posee actividad de unión al ADN, pero ninguna función enzimática obvia. XPA tiene una afinidad de unión específica para ciertos tipos de ADN dañado [132,133], que aumenta en presencia de RPA [128,134]. La unión de ADN por XPA es particularmente fuerte y específica cuando los sustratos de ADN contienen estructuras inusuales, como hebras de ADN muy retorcidas (p. Ej., Estructuras ramificadas similares a uniones de Holliday) [135]. Se determinó la estructura de la solución del C-terminal, dominio mínimo de unión al ADN de XPA [136], y se asemeja a los dominios de horquilla β en XPC (especialmente BHD1 y BHD2), lo que sugiere cierta similitud funcional entre estos dos factores NER [34] . XPA tiene un motivo de dedos de zinc en su región más N-terminal que puede estar involucrado en interacciones proteína-proteína más que en la unión al ADN.

El grupo de complementación genética A es una forma bastante común de XP, y las células de estos pacientes suelen tener una capacidad de NER residual mucho menor que las de otros grupos de XP [137]. Los pacientes que carecen de expresión de proteína XPA detectable son viables, pero a menudo tienen disfunciones neurológicas progresivas graves además de los síntomas cutáneos típicos de XP. Tales casos ocurren con una frecuencia particularmente alta en Japón debido al efecto fundador de una mutación de empalme específica del XPA gen (IVS3-1G & gt C) [138].


Activación de la quinasa dependiente de ciclina 4 (cdk4) por la quinasa asociada a MO15 de ratón.

El ensamblaje de holoenzimas funcionales compuestas por ciclinas reguladoras de tipo D y quinasas dependientes de ciclina (cdks) limita la velocidad de progresión a través de la fase G1 del ciclo celular somático de mamíferos. Los complejos entre las ciclinas de tipo D y su subunidad catalítica principal, cdk4, son catalíticamente inactivos hasta que la cdk4 unida a la ciclina sufre fosforilación en un único residuo treonilo (Thr-172). Este paso es catalizado por una quinasa de activación de cdk (CAK) funcionalmente análoga a la enzima que fosforila cdc2 y cdk2 en Thr-161/160. Aquí, demostramos que la subunidad catalítica de la CAK cdc2 / cdk2 de ratón (una proteína de 39 kDa denominada p39MO15) puede ensamblarse con una proteína reguladora presente en células de insectos o mamíferos para generar una actividad CAK capaz de fosforilar y activar enzimáticamente tanto cdk2 como cdk4 en complejos con sus respectivos socios de ciclina. Una proteína similar a la ciclina de 37 kDa recientemente identificada (ciclina H [RP Fisher y DO Morgan, Cell 78: 713-724, 1994]) puede ensamblarse con p39MO15 para activar tanto la ciclina A-cdk2 como la ciclina D-cdk4 in vitro, lo que implica que CAK recuerda estructuralmente a los propios complejos ciclina-cdk. Los antisueros producidos para la subunidad p39MO15 pueden agotar completamente los lisados ​​de células de mamíferos de la actividad CAK tanto para la ciclina A-cdk2 como para la ciclina D-cdk4, con recuperación de la actividad en los complejos inmunes resultantes. Mediante el uso de un ensayo CAK de inmunocomplejos, se detectó la actividad CAK para ciclina A-cdk2 y ciclina D-cdk4 tanto en células inactivas como invariablemente a lo largo del ciclo celular. Por lo tanto, aunque es esencial para la activación enzimática de los complejos ciclina-cdk, CAK no parece limitar la velocidad para la emergencia de células de la quiescencia ni estar sujeta al control regulador corriente arriba por mitógenos estimulantes.


Examen de biología celular 4 Clase 16

Promueve indirectamente la degradación de una proteína conocida como cohesina, que mantiene unidas las cromátidas hermanas durante la metafase.

La degradación indirecta de la cohesina hace que las cromátidas hermanas se separen al dirigirse a un inhibidor llamado securina que promueve la separación de las cromátidas hermanas.

Apunta a la ciclina mitótica para su destrucción

La célula permanecería en sus fases mitóticas y nunca se dividiría.

Los cromosomas permanecerían condensados

La ausencia de factores de crecimiento Rb (retinoblastoma) bloquea la transcripción de genes que la célula necesita para entrar en la fase S

Una de esas ciclinas es la ciclina G1 / S.

Con la ciclina G1 / S presente, los complejos CDK comienzan a agregar grupos fosfato a la proteína Rb.

El complejo proteico Mad and Rub inhibirá que CDC20 (subunidad del complejo promotor de la anafase) se una al complejo promotor de la anafase, evitando que la célula entre en anafase.

Promueven la expresión de inhibidores de CDK.

- Inducir las necesidades que necesita la célula para moverse a través de las fases del ciclo celular.

- Activará la transcripción de genes como E2F (mueve células de G1 a S) y Cyclin y CDKS.

Si se desactivan o eliminan, aumentará la proliferación celular, lo que provocará el crecimiento de órganos y un mayor riesgo de tumores.

- Transición de metafase a anafase

- Influenciado por factores ambientales

Verifique si hay daño en el ADN

Compruebe si los cromosomas están unidos a las fibras del huso.

Factores: factores de crecimiento, nutrientes, tamaño celular y daño al ADN

Asegura que la replicación del ADN se complete antes de que la célula pase de G2 a M


Abstracto

Factor de crecimiento transformante y G mediado por # x003b2 (TGF - & # x003b2)1 Previamente se ha demostrado que la detención se dirige específicamente a la inactivación de los complejos ciclina D: quinasa dependiente de ciclina (Cdk) 4 & # x0002f6. Aquí informamos que las células de carcinoma hepatocelular HepG2 humano tratadas con TGF - & # x003b2 se detienen en G1, pero retienen la actividad ciclina D: Cdk4 & # x0002f6 continuada y la proteína supresora de tumores de retinoblastoma hipofosforilada activa. De acuerdo con esta observación, las células tratadas con TGF - & # x003b2 no lograron inducir p15 INK4b, regular negativamente CDC25A o aumentar los niveles de p21 CIP1, p27 KIP1 y p57 KIP2. Sin embargo, el tratamiento con TGF - & # x003b2 dio como resultado la inactivación específica de los complejos de ciclina E: Cdk2 causada por la ausencia de la fosforilación de Thr 160 activante en Cdk2. Los lisados ​​de células completas de células tratadas con TGF - & # x003b2 mostraron inhibición de la actividad de la quinasa activadora de Cdk2 Thr 160 Cdk (CAK), sin embargo, la actividad de ciclina H: Cdk7, una CAK de mamífero previamente asumida, no se alteró. Saccharomyces cerevisiae contiene un gen CAK probado genética y bioquímicamente, CAK1, que codifica una proteína Cak1p monomérica de 44 kDa no relacionada con Cdk7. Los anticuerpos anti-Cak1p reaccionaron de forma cruzada con una proteína humana de 45 kDa con actividad CAK que estaba específicamente regulada negativamente en respuesta al tratamiento con TGF - & # x003b2. En conjunto, estas observaciones demuestran que la señalización TGF - & # x003b2 media un G1 detención en células HepG2 dirigiéndose a Cdk2 CAK y sugiere la presencia de al menos dos CAK de mamífero: uno específico para Cdk2 y otro para Cdk4 & # x0002f6.

La maquinaria básica de control del ciclo celular está compuesta por subunidades reguladoras de ciclina complejadas con subunidades catalíticas de serina y treonina cinasa dependiente de ciclina (Cdk) que fosforilan sustratos de una manera específica del ciclo celular (1 & # x020134). Activación de Cdk2 por ciclina E a finales de G1 en & # x0002fcerca del G1 punto de restricción y por ciclina A en el G1-S fase de transición y activación de ciclina B de CDC2 en G2La transición de fase & # x0002fM sugiere la participación de estos complejos ciclina: Cdk en puntos de control reguladores del ciclo celular específicos (3, 4). Por el contrario, la activación dependiente de ciclina D de Cdk4 y Cdk6 (Cdk4 & # x0002f6) en células en ciclo es constitutiva a lo largo del ciclo celular (5 & # x0201310) e indica un papel distinto de los complejos de ciclina D: Cdk4 & # x0002f6 de la de ciclina E: Cdk2. De hecho, previamente hemos demostrado que los complejos de ciclina D: Cdk4 & # x0002f6 activan la proteína supresora de tumores de retinoblastoma (pRB) por hipofosforilación en G temprana1 (8 & # x0201310), mientras que los complejos ciclina E: Cdk2 realizan la inactivación inicial, hiperfosforilación de pRB en el G tardío1 punto de restricción (8 & # x0201313).

Ciclina: Los complejos de Cdk están altamente regulados en múltiples niveles. Después de la síntesis de ciclina, la ciclina y las proteínas Cdk se ensamblan en complejos heterodiméricos inactivos que se modifican aún más mediante la fosforilación de la subunidad Cdk (4). Cdk2 contiene dos sitios de fosforilación inhibitoria en Thr 14 y Tyr 15 y un sitio de fosforilación de activación en Thr 160. Wee1 fosforila Tyr 15 en Cdk2 (21), mientras que la quinasa Cdk2 Thr 14 permanece desconocida. Thr 14 y # x0002fTyr 15 están desfosforilados por la familia de fosfatasa CDC25 de especificidad dual (A, B, C) (4). Sin embargo, la activación de los complejos de ciclina E: Cdk2 requiere la fosforilación del residuo Thr 160 en Cdk2 por la quinasa activadora de Cdk (CAK) (14).

La identidad del CAK de los mamíferos sigue siendo controvertida en la literatura. Sin embargo, basado principalmente en in vitro En los ensayos bioquímicos, los informes iniciales identificaron un complejo CAK de mamífero putativo que es miembro de la familia Cdk, a saber, ciclina H: Cdk7: Mat1 (15, 16). Sorprendentemente, por medios tanto genéticos como bioquímicos, los complejos de ciclina H: Cdk7 se identificaron posteriormente como un componente necesario de TFIIH implicado en la fosforilación del dominio terminal C de la subunidad grande de la ARN polimerasa II (17 & # x0201320). De acuerdo con estas observaciones, la inactivación del Saccharomyces cerevisiae Homólogo de cdk7, KIN28, da como resultado la pérdida de actividad TFIIH con actividad CAK continua (21). Significativamente, Larochelle et al. (22) recientemente han demostrado en Drosophila que la inactivación de Cdk7 conduce solo a una pérdida de actividad de CDC2 con actividad continua de ciclina E: Cdk2. Además, varios grupos han identificado el verdadero S. cerevisiae CAK (CAK1 & # x0002fCIV1) gen que codifica una proteína CAK monomérica de 44 kDa (Cak1p) distinta de la familia Cdk dependiente de prolina (23 & # x0201325). En conjunto, estas observaciones desafían la noción inicial percibida basada en in vitro experimentos de que los complejos de ciclina H: Cdk7 funcionan como un CAK de Cdk2 en células de mamíferos en vivo.

Se ha demostrado previamente que los complejos de ciclina D: Cdk4 & # x0002f6 están específicamente dirigidos por la señalización del factor de crecimiento transformante & # x003b2 (TGF - & # x003b2) en la mediación de un G1 detención por inducción de p15 INK4b, un regulador negativo de Cdk4 & # x0002f6, regulación negativa de CDC25A o regulación negativa de los niveles de proteína Cdk4 (26 & # x0201328). En la búsqueda de una línea celular que responda a TGF - & # x003b2 que el crecimiento se detenga con actividad continua de ciclina D: Cdk4 & # x0002f6, descubrimos la capacidad de las células de carcinoma hepatocelular humano HepG2 para someterse a una G mediada por TGF - & # x003b21 detención independiente de p15 INK4b y CDC25A, que se dirige a la inactivación de los complejos ciclina E: Cdk2. Presentamos aquí la regulación biológica de la actividad de Cdk2 CAK, independiente de la actividad de Cdk7, mediante la señalización de TGF - & # x003b2, mientras que la actividad de Cdk4 & # x0002f6 CAK no se ve afectada.


Vía de señalización CDK

La transición entre diferentes estados del ciclo celular eucariota se controla principalmente mediante puntos de control, que constan de dos familias de proteínas: proteína quinasa dependiente de ciclina (CDK) y ciclo. El primer monómero no tiene actividad enzimática y solo puede activarse cuando forma un complejo CDK-ciclina con el último. A continuación, se inicia una serie de eventos asociados con las transiciones del estado celular en el ciclo celular mediante la fosforilación específica de residuos de serina y treonina específicos en la proteína diana. Esta última es una clase de proteínas que se agregan y degradan en el ciclo celular a medida que las células cambian, y regulan su actividad formando complejos con CDK, que son esenciales para la actividad de expresión de CDK. La agregación, activación y despolimerización del complejo periódico CDK-ciclina son eventos críticos que impulsan la renovación celular del ciclo celular. La regulación de la activación e inactivación de la proteína quinasa dependiente de ciclina es fundamental para el control del ciclo celular.

CDK es una clase de proteína quinasas dependientes de ciclina, y el sustrato es una familia de quinasas de seda / treonina heterodiméricas. Hasta ahora, la familia CDKS nombrada tiene 13 miembros: CDK1

CDK13. La CDK se activa al unirse a las ciclinas, que catalizan la fosforilación de los sustratos e impulsan la fase del ciclo celular para completar la síntesis de ADN y la mitosis, lo que conduce al crecimiento y la proliferación celular. Al mismo tiempo, las CDK también pueden desempeñar un papel regulador negativo en combinación con el factor inhibidor de las CDK (CKI), inhibir la progresión del ciclo celular y prevenir la división celular. En las diferentes fases del ciclo celular, la fase G1 de control principal es CDK2, 4 y 6, y la fase S y la fase G2 dependen de CDK2, mientras que la fase M está regulada principalmente por CDK1. En vista del importante papel de la anomalía de la actividad de CDK2 en la tumorigénesis y el desarrollo, los inhibidores de CDK2 se han convertido en una nueva dirección en la investigación del tratamiento de tumores. Los estudios han demostrado que la inhibición directa de la actividad de la quinasa CDK2 o la inhibición de CDK2 mediante la mejora de p27 y p21 puede provocar la inhibición del crecimiento de las células de cáncer de ovario. La ciclina es una familia de proteínas reguladoras positivas y es un factor activo de CDK. Actualmente se han encontrado 8 tipos de ciclina, que se clasifican en A, B, C, D, E, F, G y H. La ciclina forma principalmente un complejo ciclina-CDK con CDK en la regulación del ciclo celular, activando así la CDK actividad. Por ejemplo, las células de control del complejo Cyclin D y CDK 4/6 cruzan la fase G0 / G1, las células de control del complejo Cyclin E y CDK2 de G0 / G1 que entran en la fase S, las células de control del complejo Cyclin A y CDK2 que experimentan la síntesis de ADN en la fase S, y La ciclina B forma un complejo con CDK1 para controlar las células en la fase G2 / M. Entre las ciclinas, la ciclina D y la ciclina E son las más estudiadas. La ciclina incluye principalmente los subtipos CyclinD1, D2 y D33, de los cuales cyclinD1 es el subtipo principal, también conocido como gen-1 del adenoma paratiroideo, que es una proteína clave que regula la fase G1, compuesta principalmente de CDK4 / CDK6 sintasa. La célula pasa a través de la fase G1 y el sustrato corriente abajo de CyclinD1-CDK4 / CDK6 es la proteína de blastoma de membrana retiniana (Rb) y el factor de transcripción E2F. Yang et al encontraron que la ciclina D1 se expresa en gran medida en el cáncer de mama y se expresa junto con la progresión del cáncer de mama. El aumento de la expresión de ciclina D1 está relacionado con la formación y metástasis del cáncer de mama. Se han encontrado hallazgos similares en cáncer de cuello uterino, cáncer de endometrio, mieloma múltiple, etc. Y algunos estudios han encontrado ciclina en cáncer de hígado y cáncer de pulmón de células no pequeñas. Los resultados de sobreexpresión de ciclina D1 son consistentes.

Vía de señalización CDK

    Cascada de la vía de señalización CDK

La conducción de la vía de señalización de CDK comienza con la unión de CDK y ciclina. El sustrato E2F corriente abajo de cyclinD1-CDK4 / CDK6 promueve la transcripción del gen de ciclina E. La ciclina E se une a CDK2 y activa CDK2 para formar un complejo ciclina E-CDK2, que fosforila pRb y P107. El sustrato corriente abajo regula las células para que entren en la fase S. La expresión de ciclina E también está regulada por la ubiquitinación del complejo SCF (caja-proteína SKP1-CUL1F). El Instituto Chino de Microbiología encontró una nueva interacción entre las ciclinas / CDK, la proteína y Ankrd17, el sustrato de la ciclina E / CDK2, una proteína reguladora positiva en la transición de fase G1 / S. La sobreexpresión de Ankrd17 promueve la entrada de la célula en la fase S, mientras que la expresión disminuida de Ankrd17 inhibirá la replicación del ADN, evitará la progresión del ciclo celular y aumentará la expresión de p53 y p21. Du et al encontró que la aparición de tumores de mama en ratones transgénicos Myc se asoció con la sobreexpresión de ciclina E. En células de cáncer de mama humano, también se encontró que los pacientes con cáncer de mama con alta expresión de ciclina E tenían una mayor malignidad en cáncer de pulmón de células no pequeñas y tracto gastrointestinal. También se encontró una alta expresión de ciclina E en el cáncer. Estos hallazgos sugieren que la ciclina E está estrechamente relacionada con la tumorigénesis.

La regulación de la vía de señalización de CDK se puede dividir principalmente en regulación positiva y regulación negativa. Regulación positiva de la fosforilación de CDK: en la secuencia de aminoácidos de CDK, hay residuos de treonina conservados (posición 161 de CDC2 CDK2 somático de 160 bits). Este residuo está oculto en el bucle T. Después de la fosforilación, la estructura del anillo T cambia, lo que aumenta la afinidad de la ciclina por la CDK y hace que el complejo CDK sea muy activo. La CDK7 se une a la ciclina H y a otra subunidad pequeña y se fosforila en el residuo de treonina 170º, por lo que tiene la capacidad de fosforilar otras CDK. Regulación negativa de la fosforilación de CDK: la inhibición de la actividad del complejo CDK se puede lograr interrumpiendo la unión a ciclina y desfosforilación del sitio de la treonina. Los experimentos han demostrado que, además de CDK 4, la fosforilación simultánea en el 14º residuo de treonina y el 15º residuo de tirosina también pueden inhibir la actividad del complejo CDK. Ambos residuos se encuentran cerca del sitio de unión de ATP. Su fosforilación afecta la unión del ácido fosfórico al ATP. En la levadura de fisión, es probable que Weel y Mik1 sean quinasas de residuos de tirosina, y Weel fosforila Nim1 / Cdr1 inhibe su actividad. To de-phosphorize the negative effects, CDC25 is required to dephosphorylate the two sites. CDC2, MAP, MAM 2 kinase phosphorylation of CDC25 N-terminal increases CDC25 activity. At the same time, PP1, PP2A can dephosphorylate CDCD25. It is not difficult to see that this is a network of phosphatase and kinase. In addition, some CDK inhibitors can effectively inhibit the conduction of CDK signaling pathway. In recent years, a batch of eggs that can be combined with CDK for one week has been isolated. The white complexes specifically bind to and inhibit the activity of the protein called the weekly protein-dependent enzyme to inhibit the protein. The confirmed proteins are FARI, p40 (slel / s DB25) and PHOsl, which are inhibited separately. Kinase activity of CDC28-CLN, CDC28-CLB and PHO 85-PHO8 complexes p21(CIPI / WAF / CAPZO / SDI), P27(KIP in mammals), p16 , NK , and p15NK4β, which inhibit the activity of CDKZ-cyclin, CDK4 -cyclin, CDK4-cyclin and CDK6-cyclin complex, respectively. The mechanism by which CKI regulates C D K is unclear. However, there is evidence that they may directly affect the activity of the enzyme by affecting the binding of the enzyme to the substrate. For example, FARI p4. P21 can be phosphorylated by its target CDK-period protein complex, and p40 reduces the Vmax and Km of its target CDC 28 - CLB complex combined with the substrate. Although most CKIs are more susceptible to recognizing the CDK-cyclin complex and are less likely to recognize monomeric CDK, p16IN4K binds to CDK 4 monomers en vivo, so by blocking CDK 4 the binding of the protein is inhibited. The inhibition of c D K activity by CKI may be an important factor in cell cycle regulation. Because the regulation of CKI level is complex and related to the tumor suppressor gene p53, the second messenger cAMP and the transforming growth factor TGF, the activity regulation of CDK and the response of the cell response environment are changed. Linkages align cell transitions in the cell cycle with environmental changes. Some of the regulation of CKI is carried out at the transcriptional level. For example, when DNA is damaged or cell ages, p53 induces transcription of p21 and blocks the cell cycle. As in human keratinocytes, the conversion growth factor TGFβ enhances the expression of the p15NK4β gene. The regulation of CKI can also be carried out at the post-translational level. For example, the total 2P7 content in the epidermal cells of the leech is unchanged in the cell cycle and is not affected by the TGF. However, when the TGF is treated, the p27 is a CDK-cyclin. The inhibitory effect of the complex is increased, and the treatment of TGF may cause 2P7 to be released from a bound state.

Studies have shown that although the total phosphorylation level of CDK2 is unchanged in senescent cells, the phosphorylation levels in cyclin D, E, and CDK are decreased, resulting in cell arrest in the G1 phase. Furthermore, senescent cells do not have mRNA and products of cyclin A, cyclin B, CDK4, and CDC 2. In addition, there may be no mature mRNA and products of PCN A due to the lack of post-transcriptional regulation. At the same time, the expression of P21 in senescent cells is 20 times higher than that of normal proliferating young cells, which may be the cause of cell senescence and cell cycle delay.

Studies have pointed out that CDK5 expression is an independent factor in the evaluation of prognosis in patients with gastric cancer. The 5-year survival rate of patients increases with the increase in CDK5 expression in cancer tissues. In the diagnosis and treatment of gastric cancer, CDK5 protein is expected to become a target.


Abstracto

K cyclin encoded by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus confers resistance to the cyclin-dependent kinase (cdk) inhibitors p16 Ink4A , p21 Cip1 , and p27 Kip1 on the associated cdk6. We have previously shown that K cyclin expression enforces S-phase entry on cells overexpressing p27 Kip1 by promoting phosphorylation of p27 Kip1 on threonine 187, triggering p27 Kip1 down-regulation. Since p21 Cip1 acts in a manner similar to that of p27 Kip1 , we have investigated the subversion of a p21 Cip1 -induced G1 arrest by K cyclin. Here, we show that p21 Cip1 is associated with K cyclin both in overexpression models and in primary effusion lymphoma cells and is a substrate of the K cyclin/cdk6 complex, resulting in phosphorylation of p21 Cip1 on serine 130. This phosphoform of p21 Cip1 appeared unable to associate with cdk2 in vivo. We further demonstrate that phosphorylation on serine 130 is essential for K cyclin-mediated release of a p21 Cip1 -imposed G1 arrest. Moreover, we show that under physiological conditions of cell cycle arrest due to elevated levels of p21 Cip1 resulting from oxidative stress, K cyclin expression enabled S-phase entry and was associated with p21 Cip1 phosphorylation and partial restoration of cdk2 kinase activity. Thus, expression of the viral cyclin enables cells to subvert the cell cycle inhibitory function of p21 Cip1 by promoting cdk6-dependent phosphorylation of this antiproliferative protein.

Progression through the mammalian cell cycle is primarily regulated during the G1 phase. D-type cyclins complexed with either cyclin-dependent kinase 4 (cdk4) or cdk6 collaborate with cyclin E/cdk2 to phosphorylate the retinoblastoma protein, pRb. This multisite phosphorylation inactivates pRb, hence removing its restraining influence on S-phase entry (1). However, to prevent unscheduled progression through the cell cycle, the G1-specific cyclin/cdk holoenzymes are held in check by p21 Cip1 and p27 Kip1 (34). These inhibitory proteins stoichiometrically bind to both the cyclin and cdk subunits and inhibit their enzyme activity through steric hindrance within the catalytic cleft (10, 15, 30, 32). p21 Cip1 and p27 Kip1 can also prevent the activating phosphorylation of the cdk subunit (2, 17). In addition to their inhibitory roles, p21 Cip1 and p27 Kip1 can promote D-type cyclin/cdk complex formation these heterotrimeric complexes retain substantial kinase activity (20, 36). Such trimeric complexes are believed to promote cell cycle progression through the sequestration of p21 Cip1 and p27 Kip1 , releasing cyclin/cdk2 complexes from inhibitory interactions (28).

Our understanding of the roles of endogenous cell cycle regulatory proteins has been greatly increased through the analysis of the functions of a variety of viral proteins that promote proliferation. The cyclin encoded by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) (K cyclin) is the viral homologue of the mammalian D-type cyclins, and it preferentially interacts with endogenous cdk6 (7, 13). K cyclin/cdk6 complexes have unusual properties, preeminent being their ability to maintain kinase activity in the presence of p21 Cip1 and p27 Kip1 (37). We have previously shown that K cyclin is able to circumvent the G1 blockades imposed by p21 Cip1 and p27 Kip1 (37). To overcome the arrest imposed by p27 Kip1 , K cyclin promotes the cdk6-dependent phosphorylation of p27 Kip1 on threonine 187, thereby stimulating p27 Kip1 degradation (11, 22). The phosphorylation-resistant T187A mutant of p27 Kip1 is able to restrict cell cycle progression even in the presence of K cyclin (22, 37). These data indicate that K cyclin expression provides conditions that are permissive for cyclin/cdk2 activation by eliminating p27 Kip1 and that the viral cyclin must facilitate the activation of endogenous cyclin/cdk complexes to enable cell cycle progression (21, 34).

To further dissect the properties of the viral cyclin and shed additional light on the control of cdk inhibitors in vivo, we addressed the mechanism by which K cyclin can bypass the G1 arrest imposed by p21 Cip1 , given that this cdk inhibitor, like p27 Kip1 , can inhibit the G1-specific cyclin/cdk holoenzymes. Our results demonstrate that K cyclin/cdk6 can phosphorylate p21 Cip1 on serine 130 (S130) in vitro and in vivo and that this phosphorylation is essential for K cyclin-mediated release of a p21 Cip1 -imposed G1 arrest. Also, we show that K cyclin expression enabled S-phase entry under oxidative stress-induced cell cycle arrest resulting from elevated levels of p21 Cip1 . This was associated with p21 Cip1 phosphorylation and partial restoration of cdk2 kinase activity.


Activation of cyclin-dependent kinases CDC2 and CDK2 in hepatocellular carcinoma

*Randy Y.C. Poon, Department of Biochemistry, Hong Kong University of Science and Technology, Clear Water Bay, Hong Kong, Tel: 85223588703. Fax: 85223581552. e-mail: [email protected] Search for more papers by this author

Department of Biochemistry, Hong Kong University of Science and Technology, Clear Water Bay, Hong Kong,

Department of Pathology, The University of Hong Kong, Queen Mary Hospital, Hong Kong,

Department of Surgery, The University of Hong Kong, Queen Mary Hospital, Hong Kong,

Department of Medicine, Hennepin County Medical Center, Minneapolis, Minnesota 55415, USA,

Department of Molecular and Cellular Biology, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Kanazawa University, 13-1, Takara-machi, Kanazawa 920-0934, Japan

Department of Biochemistry, Hong Kong University of Science and Technology, Clear Water Bay, Hong Kong,

*Randy Y.C. Poon, Department of Biochemistry, Hong Kong University of Science and Technology, Clear Water Bay, Hong Kong, Tel: 85223588703. Fax: 85223581552. e-mail: [email protected] Search for more papers by this author

Abstracto

Abstracto: Fondo: The cyclin-dependent kinases (CDKs) CDC2 and CDK2 are key regulators of the cell cycle. The expression of the CDK alone does not necessary reflect their true activities because they are highly regulated by post-translational mechanisms. Human hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common cancers in the world, but the kinase activities of CDKs in HCC have not been examined.

Métodos: Here we examined the protein expression and kinase activities associated with CDC2 and CDK2 in HCC and the corresponding non-tumorous liver tissues.

Resultados: CDC2 and CDK2 are activated in HCC in over 70% and 80% of the cases, respectively, but have little correlation with clinical parameters and PCNA expression. Interestingly, PCNA was readily detectable in extracts from non-tumorous liver, but more than 60% of samples contain higher concentration of PCNA in HCC than the corresponding non-tumorous tissues. CDC2 and CDK2 are generally activated in the same HCC samples, but the extent of their activation varied significantly, suggesting that the pathways leading to the activation of CDC2 and CDK2 can be regulated independently. Both positive regulators of CDK activity like cyclins and CDKs, and negative regulators of CDK activity like p21 CIP1/WAF1 and Thr14/Tyr15 phosphorylation were up-regulated in HCC. Conclusión: CDC2 and CDK2 are activated in HCC, and this may be due to a complex interplay between the level of the cyclin, CDK, CDK inhibitors, and inhibitory phosphorylation.



Comentarios:

  1. Chagai

    Resulta que las propiedades son eso

  2. Garrson

    Estoy listo para ayudarte, pregúntame.

  3. JoJotaur

    Creo que se cometen errores.

  4. Baran

    No

  5. Jose

    Entonces sucede.



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