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1.10: Evaluación de la unión de antibióticos a la albúmina del suero sanguíneo mediante espectroscopia de fluorescencia - Biología

1.10: Evaluación de la unión de antibióticos a la albúmina del suero sanguíneo mediante espectroscopia de fluorescencia - Biología


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10.1 Objetivos de aprendizaje

En este laboratorio estudiarás una de las funciones más importantes de las proteínas. Este laboratorio se centra en la principal proteína extracelular del torrente sanguíneo, la albúmina de suero humano. Para estudiar la unión, hemos elegido una medida óptica sensible, la fluorescencia. Utilizará la gran cantidad de datos de esta técnica sensible para estudiar los detalles de la unión de los antibióticos a la albúmina.

10.2 Papel biológico de la albúmina sérica

La albúmina es la principal proteína circulante en el torrente sanguíneo que comprende aproximadamente la mitad de la proteína sérica total. Su estructura contiene muchos bolsillos hidrofóbicos que se unen a una variedad de moléculas biológicas. A continuación se muestran varios ejemplos:

  • Cuando los glóbulos rojos mueren y se lisan, se libera el exceso de hemo. La albúmina se une a este exceso eliminándolo del torrente sanguíneo.
  • Las hormonas hidrófobas, como las tiroxinas o los esteroides, a menudo se unen a la albúmina.
  • Muchos fármacos aniónicos e hidrófobos se unen a la albúmina. Esta unión tiene un gran impacto en la eficacia de los fármacos. Esta unión puede ralentizar la distribución del fármaco a los tejidos, reducir el aclaramiento del fármaco y provocar una pérdida general de la eficacia del fármaco. Las interacciones entre fármacos también están mediadas por la albúmina sérica. Por ejemplo, un fármaco puede provocar un aumento en la disponibilidad de un segundo fármaco (aumentando así la dosis eficaz del fármaco) si los fármacos compiten por el mismo sitio de unión de la albúmina sérica.

Durante este laboratorio, comprobará la afinidad de unión entre la albúmina y un antibiótico común, la levofloxacina (Levaquin®).

10.3 Antibióticos fluoroquinolínicos

La levofloxacina (Levaquin®) es un miembro de la clase de antibióticos fluoroquinolina. Estos fármacos se conocen desde hace unos 50 años, pero los derivados especialmente eficaces no estuvieron ampliamente disponibles hasta la década de 1980. Estas son fluoroquinolinas de "segunda generación" e incluyen los medicamentos comunes, ciprofloxacina (Cipro®) y ofloxacina (Floxin®).

La levofloxacina (Levaquin®) es una fluoroquinolona de "tercera generación" y es simplemente el isómero biológicamente activo de la ofloxacina (una mezcla racémica).

Las fluoroquinolonas tienen un sitio de acción único, inhibiendo la ADN girasa bacteriana (topoisomerasa tipo II) y la topoisomerasa IV. Estas enzimas desenrollan el ADN y son necesarias para la replicación del ADN. Las fluoroquinolinas bloquean el desenrollamiento del ADN y, por tanto, bloquean la replicación bacteriana. Son más eficaces contra las bacterias Gram negativas, aunque los fármacos de última generación también son eficaces contra algunas bacterias Gram positivas y anaerobias.

10.4 Estructura de proteínas, aminoácidos aromáticos y fluorescencia

Las proteínas son polímeros de aminoácidos. Las cadenas laterales de aminoácidos (grupos R) son las principales responsables de las propiedades únicas de cada proteína. Por ejemplo, si una proteína tiene muchos aminoácidos con cadenas laterales de alquilo, entonces la proteína es relativamente hidrófoba. O, si la proteína tiene muchos aminoácidos con cadenas laterales que contienen carboxilato, entonces la proteína tiende a tener carga negativa.

Los aminoácidos aromáticos, fenilalanina, tirosina y triptófano, contribuyen a la propiedad única de las proteínas, la fluorescencia. La fluorescencia es un proceso mediante el cual una molécula absorbe luz y luego la emite de nuevo (normalmente a una longitud de onda más larga; Figura 10.1).

Los aminoácidos aromáticos tienen un pico de absorbancia entre 260 nm y 290 nm. Emiten luz como máximo desde aproximadamente 290 nm hasta aproximadamente 350 nm.

10.5 Medición de fluorescencia

Para medir la fluorescencia, siempre se establecen dos longitudes de onda, la longitud de onda de la luz que irradia la muestra (la excitación o absorbancia λ) y la longitud de onda de la luz emitida que se va a medir (emisión λ). Para escanear un espectro de emisión, la absorbancia / excitación λ se fija y un monocromador escanea a través de las longitudes de onda de emisión (Figura 10.2).

Para escanear un espectro de excitación, la emisión λ se fija y un monocromador escanea a través de longitudes de onda de luz que irradian la muestra (Figura 10.3).

Las moléculas fluorescentes, como los aminoácidos aromáticos, tienen espectros de emisión y excitación característicos; estos espectros pueden servir para identificar moléculas. Por ejemplo, las formas de los picos, así como las longitudes de onda de los picos, son características de moléculas específicas. El triptófano tiene un pico de emisión amplio a aproximadamente 350 nm, mientras que la tirosina tiene un pico de emisión estrecho a aproximadamente 305 nm. La diferencia de longitud de onda entre excitación y emisión también es característica. Dependiendo de los niveles de energía electrónica de una molécula, la diferencia entre la excitación y la emisión puede ser grande (se pierde mucha energía antes de que se emita la luz) o pequeña (se pierde poca energía antes de que se emita la luz). Por ejemplo, el triptófano tiene una diferencia de aproximadamente 60 nm entre la excitación y la longitud de onda de emisión, mientras que la tirosina tiene solo una diferencia de aproximadamente 15 nm (Figura 10.4). El triptófano pierde más energía antes de la emisión, mientras que la tirosina pierde menos.

10.6 Espectroscopía síncrona

La espectroscopia síncrona selecciona fluoróforos con una diferencia de energía especificada entre excitación y emisión. Esta técnica depende de mantener una diferencia constante entre la longitud de onda de excitación y la longitud de onda de emisión. El monocromador de excitación escanea longitudes de onda simultáneamente y a la misma velocidad que el monocromador de emisión. Dado que los monocromadores están sincronizados entre sí (espectroscopia síncrona) se mantiene una constante Δλ. El uso de Δλ = 15 nm significa que el espectrofluorómetro es sensible a los grupos que emiten luz fluorescente después de un pequeño cambio en la longitud de onda, es decir, tirosina. Establecer un Δλ = 60 nm permite que el espectrofluorómetro "vea" grupos que emiten luz fluorescente después de un gran cambio en la longitud de onda, es decir, triptófano. Al establecer un Δλ dado, el espectrofluorómetro puede monitorear aminoácidos específicos seleccionados.

10.7 Análisis de datos

El objetivo de este laboratorio es monitorear la unión de levofloxacina a la albúmina.

La unión de levofloxacina es proporcional al cambio de fluorescencia. Dado que la fluorescencia disminuye, el cambio se denomina extinción de la fluorescencia. Para medir la unión de levofloxacina por albúmina en función de la concentración de levofloxacina, es necesario representar gráficamente la extinción de la fluorescencia frente a la concentración de levofloxacina en la cubeta. En general, la unión entre una proteína (P) y un ligando (L) se ajusta a la siguiente ecuación:

P + L PL

dónde

En la mayoría de los experimentos, [L] (el independiente variable) es variable y [PL], la dependiente variable, se mide. La ecuación 1 se reordena algebraicamente para poner la variable dependiente a la izquierda y la variable independiente a la derecha. Tenga en cuenta que la ecuación 2 tiene la misma forma que la ecuación de Michaelis-Menten (Figura 10.5).

y

Es importante reconocer que la constante de disociación, KD, es numéricamente igual a la [L] que produce Entonces, la KD se puede determinar a partir de ambos gráficos. Desde la extinción de la fluorescencia es igual a ,

Esta ecuación es análoga a la Ecuación 3 y conduce a una gráfica como se muestra en Figura 10.6.

Esta gráfica es similar a las dos gráficas que creó para sus valoraciones. Sin embargo, no es lo mismo. Esta gráfica grafica el gratis [levafloxacina], es decir, la [levafloxacina] total en la cubeta menos la [levafloxacina] unida a la albúmina. Tus dos parcelas graficaron el total [levafloxacina] en la cubeta. Sus concentraciones deben corregirse antes de poder calcular una constante de equilibrio. Después de la reordenación y sustitución de la Ecuación 4, se deriva la Ecuación 5:

La ecuación 6 permite el cálculo de KD. Además, esta ecuación se establece en forma lineal utilizando la ecuación pendiente-intersección, y = m X + b. Tenga en cuenta que esta ecuación usa Flinicial, ΔFl y Fl. La espectroscopia de fluorescencia puede proporcionar información sobre los cambios en la conformación de las proteínas. Tanto la fluorescencia de la tirosina como del triptófano se desplazan al azul, si los aminoácidos se mueven a un entorno más hidrofóbico (no polar) y al rojo si los aminoácidos se mueven a un entorno más hidrofílico (polar) (Figura 10.7).

Observe el cambio en el pico λ cuando se agrega más levofloxacina tanto para la titulación n. ° 1 como para la titulación n. ° 2. ¿Qué puede concluir sobre el entorno cambiante alrededor de los fluoróforos?

PROCEDIMIENTOS

Las necesidades de reactivos y equipos se calculan por seis equipos de estudiantes. Hay un exceso de ~ 20% incluido.

Equipo / cristalería necesarios:

  1. Tres juegos de micropipetas de 20-100 μl, 2-20 μl y 1-10 μl
  2. cubeta estándar para espectrofluorómetro

Reactivos necesarios:

  1. 10 ml de levofloxacina 0,014 M en tris 0,05 M, pH = 7,0
  2. 100 ml de 1 × 10-5 Albúmina sérica M en tris 0,05 M, pH = 7,0

Procedimiento experimental:

Titulación # 1:

  1. Establezca el espectrofluorómetro en Δλ = 15 nm.
  2. Pipetee 2,0 ml de albúmina de suero bovino (1 × 10-5 METRO; Tris 0,05 M, pH = 7,0) en la cubeta de fluorescencia. Mida los espectros sincrónicos de 250 nm a 450 nm.
  3. Añada 1 μl de levofloxacina 0,014 M (tris 0,05 M, pH = 7,0). Mida los espectros sincrónicos de 250 nm a 450 nm.
  4. Repita las adiciones de levofloxacina seguidas de mediciones fluorescentes sincrónicas dos veces más.
  5. Añada 2 μl de levofloxacina 0,014 M. Mida los espectros sincrónicos de 250 nm a 450 nm.
  6. Repita las adiciones de levofloxacina seguidas de mediciones fluorescentes sincrónicas cuatro veces más.
  7. Debería tener ocho espectros diferentes en este punto. Trace los datos de la siguiente manera:
    1. Cree una superposición de todos los espectros.
    2. Registre la fluorescencia a una excitación λ = 287 nm para cada espectro.
    3. Imprimir espectros de superposición.
  8. Enjuague la cubeta cuidadosamente con agua destilada. La solución de albúmina se puede desechar en el fregadero.

Titulación # 2:

  1. Repita el mismo procedimiento, pero configure el espectrofluorómetro en Δλ = 60 nm.
  2. Enjuague la cubeta cuidadosamente con agua destilada. La solución de albúmina se puede desechar en el fregadero.

Análisis de los datos:

1. Calcule la extinción de la fluorescencia:

Tenga en cuenta que la extinción de la fluorescencia varía de 0 a 1.

2. Calcule la concentración de levofloxacina en la cubeta; [levofloxacina]taza decorativa para cada adición. Recuerde que la levofloxacina es diluido cuando se agrega a la cubeta. Necesitas usar la ecuación de dilución, M1V1 = M2V2, donde M1 = concentración de stock de levofloxacina, V1 = volumen total de levofloxacino añadido a la cubeta, M2 = la concentración de la cubeta de levofloxacino, y V2 = el volumen total en la cubeta.

3. Grafique la extinción de la fluorescencia frente a [levofloxacina]taza decorativa para titulación n. ° 1 y titulación n. ° 2.

4. Determine KD valores para la valoración n. ° 1 y la valoración n. ° 2 de la siguiente manera.

una. Trama versus [Levofloxacina]curva para titulación n. ° 1 y titulación n. ° 2. Tenga en cuenta que estamos usando la forma lineal de KD ecuación (ver Ecuación 5).

B. KD = de este gráfico.

Notas para el instructor

El experimento del capítulo 10 utiliza la versatilidad de un espectrofluorómetro de grado de investigación. El espectrofluorómetro ofrece una vista completa de los cambios espectrales observados. Los estudiantes miden espectros completos y luego analizan la fluorescencia en longitudes de onda específicas. La espectroscopia sincrónica es posible con tal espectrofluorómetro. También se puede utilizar un fluorómetro más básico con filtros en lugar de monocromadores. En este caso, se debe proporcionar al alumno los espectros pertinentes.

Esquema del informe de laboratorio y distribución de puntos

Introducción

  1. Varias frases que definen el objetivo / propósito de este experimento. (2 ptos.)

Datos

  1. Una tabla que informa la fluorescencia en función del volumen total de solución de levofloxacina añadida para la valoración n. ° 1. (2 ptos.)
  2. Una tabla que informa los mismos datos para la titulación n. ° 2. (2 ptos.)

Resultados

  1. Un ejemplo del cálculo que utilizó para encontrar las concentraciones de levofloxacina en la cubeta. (2 ptos.)
  2. Cuatro parcelas:
    1. Apagado fluorescente frente a [levofloxacina]taza decorativa para titulación n. ° 1 y n. ° 2. (4 pts. Cada uno)
    2. vs. [levofloxacina]taza decorativa para titulación n. ° 1 y n. ° 2. Determine la KD de cada parcela. (5 pts. Cada uno)

Análisis

  1. Acceda a los espectros de excitación y emisión de fluorescencia para fenilalanina, tirosina y triptófano a través de Internet. Responda las siguientes cuatro preguntas. (8 ptos.)
    1. Estime las longitudes de onda máximas para la absorción (a λ> 230 nm) y la emisión (a λ> 250 nm) para cada aminoácido.
    2. ¿Cómo se relacionan las longitudes de onda de absorción máxima con las longitudes de onda de emisión máxima? Por ejemplo, ¿la luz emitida tiene una energía más baja o más alta que la luz absorbida? Explica brevemente.
    3. ¿Qué aminoácido muestra el mayor cambio de energía de la absorción a la emisión? Explica tu razonamiento.
    4. Clasifique estos tres aminoácidos de más fluorescentes a menos fluorescentes. Explique brevemente su razonamiento.
  2. Identifique la titulación (Δλ = 15 nm o Δλ = 60nm) que monitorea la fluorescencia de la tirosina y la titulación que monitorea la fluorescencia del triptófano. ¿Qué aminoácido representa la mayor parte de la fluorescencia de la albúmina? Explica brevemente. ¿Qué aminoácido se apaga más por la unión de levofloxacina? Explica brevemente. (6 ptos.)
  3. ¿Existe evidencia de un cambio en la conformación de la albúmina causado por la unión de levofloxacina? Si hay evidencia de un cambio de conformación, ¿las tirosinas están cambiando su entorno (quedando más expuestas al solvente o más enterradas en el interior de la proteína)? Responda la misma pregunta para los triptófanos. Explique brevemente cómo ser lo más específico posible. (10 ptos.)


Ver el vídeo: Proteína C-Reactiva: un marcador de inflamación (Junio 2022).


Comentarios:

  1. Akhil

    Seguramente tiene razón

  2. Marquis

    ¿Y qué hacer en este caso?

  3. Xicohtencatl

    Lamento, pero no puedo ayudar a nada. Lo sé, encontrarás la decisión correcta. No se desesperen.



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