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¿El ruido termodinámico determina la expresión génica?

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Me pregunto si el ruido térmico puede determinar aleatoriamente la expresión génica y de qué manera. Al buscar el 'ruido transcripcional' y celular, se encuentran indicios de la dinámica celular difusiva que se basa en colisiones entre reactivos (por ejemplo, ARN polimerasa y ADN), ver wiki. Pero la pregunta es si hay alguna investigación que haya tratado de evaluar también si y cómo también se puede establecer un vínculo termodinámico, es decir, si el movimiento estocástico browniano de las moléculas también puede desempeñar un papel en la expresión aleatoria de una u otra vía. ¿Algún artículo interesante que sugerir?


La integración de contextos termodinámicos y de secuencia mejora la predicción de la unión proteína-ARN

Afiliaciones Departamento de Ciencias de la Computación, Universidad de Illinois en Urbana-Champaign, Urbana, Illinois, Estados Unidos de América, Escuela de Información Electrónica e Ingeniería Eléctrica, Universidad Jiao Tong de Shanghai, Shanghai, China

Contribuyó igualmente a este trabajo con: Yufeng Su, Yunan Luo

Roles Metodología, Visualización, Redacción - borrador original, Redacción - revisión y edición

Departamento de Afiliación de Ciencias de la Computación, Universidad de Illinois en Urbana-Champaign, Urbana, Illinois, Estados Unidos de América

Visualización de roles, redacción - borrador original

Departamento de Afiliación de Ciencias de la Computación, Universidad de Illinois en Urbana-Champaign, Urbana, Illinois, Estados Unidos de América

Metodología de roles, software

Departamento de Afiliación de Ciencias de la Computación, Universidad de Illinois en Urbana-Champaign, Urbana, Illinois, Estados Unidos de América

Conceptualización de roles, curación de datos, análisis formal, metodología, supervisión, redacción - borrador original, redacción - revisión y edición

Departamento de Afiliación de Ciencias de la Computación, Universidad de Illinois en Urbana-Champaign, Urbana, Illinois, Estados Unidos de América


Fondo

En el estudio de los procesos biológicos, la mayoría de nuestras observaciones se basan en mediciones realizadas a escala macroscópica, como un trozo de tejido o la colección de células en una placa de cultivo de tejidos, mientras que los procesos en sí son impulsados ​​por eventos que ocurren en un escala microscópica que representa eventos dentro de cada célula individual. La paradoja aquí es que, macroscópicamente, los procesos biológicos a menudo parecen deterministas y están impulsados ​​por lo que observamos como el comportamiento promedio de millones de células, pero microscópicamente esperamos la biología, impulsada por moléculas que tienen que unirse e interactuar en un entorno complejo. , tener un componente estocástico. De hecho, los estudios de regulación transcripcional a nivel de una sola célula han descubierto ejemplos de comportamiento no uniforme de la expresión génica en células genéticamente idénticas. Levsky et al. [1] estuvieron entre los primeros en perfilar los niveles de expresión génica en células individuales y sus resultados proporcionaron evidencia directa de patrones de expresión variables en células por lo demás idénticas. Ozbudak et al. [2] cuantificó el efecto directo que las fluctuaciones en las especies moleculares tenían sobre la variación de los niveles de expresión génica en células isogénicas. Al modificar de forma independiente las tasas de transcripción y traducción de una única proteína indicadora fluorescente, pudieron observar los efectos posteriores que esto tenía sobre la expresión de la proteína. A partir de estos experimentos, los autores pudieron concluir que la producción de proteínas se produce en ráfagas bruscas y aleatorias. Esto fue explorado más a fondo por Cai et al. [3], quien desarrolló un ensayo basado en microfluidos para observar la producción de proteínas en tiempo real dentro de una célula viva. Proporcionan una prueba experimental de que las proteínas se expresan en ráfagas y demuestran que el número de moléculas por ráfaga sigue una distribución exponencial. Si bien esto representa un avance importante, los mecanismos que gobiernan este comportamiento aún no se conocen por completo y la construcción de modelos relevantes requiere cierto conocimiento de cada uno de los procesos básicos involucrados en la ruta del ADN al ARN y a la proteína.

Durante los últimos 30 años, se han propuesto numerosos modelos matemáticos de expresión de genes estocásticos [4, 5]. Rao et al. [6] esbozan algunos de los enfoques más generales y muestran cómo varios investigadores los han mejorado para convertirlos en modelos más sofisticados. Uno de los modelos más básicos es una ecuación diferencial estocástica que monitorea la tasa de producción de una especie molecular (ADN, ARN o proteína). Esta es simplemente una ecuación diferencial con un término de ruido aleatorio y un proceso estocástico o variable aleatoria que da cuenta de la cantidad de molécula disponible en un momento dado. Estos modelos que representan componentes de un sistema particular se acoplan matemáticamente para predecir los niveles de salida de genes, ARNm y proteínas producidos dentro de una sola célula. Sin embargo, una pregunta básica que queda por explorar por completo es si existe evidencia de estos elementos estocásticos y si la expresión génica es realmente un proceso estocástico. Con respecto al ARN, las respuestas a estas preguntas, hasta ahora, han sido esquivas. El problema es que casi la totalidad de los datos de expresión de ARN provienen de grandes muestras en las que los niveles de expresión génica observados son un promedio general de millones de células. Sin embargo, lo que en última instancia queremos comprender es la distribución de los niveles de ARN en células individuales, algo que ha sido difícil de medir. Aquí proponemos una solución simple pero elegante a este problema, al que nos referimos como 'Biología Mesoscópica'. En este enfoque, realizamos experimentos entre los niveles microscópico y macroscópico, trabajando con un número pequeño pero finito de células donde se pueden realizar mediciones fácilmente pero donde la evidencia de procesos estocásticos que operan a nivel celular no se pierde a través del promedio biológico que ocurre cuando en muestras grandes.

Como demostración del poder del enfoque mesoscópico, demostramos por primera vez que los niveles de transcripción de ARN obedecen a las estadísticas de Poisson para genes expresados ​​en varios niveles dentro de la célula. Comenzamos modelando el número de copias de ARNm dentro de una célula como una variable aleatoria de Poisson y derivamos una solución analítica que captura la aleatoriedad en la expresión génica, que se manifiesta como un aumento en la variabilidad biológica medida a medida que disminuimos el número de células analizadas en un experimento en particular. Usando un experimento de serie de dilución y midiendo la expresión de nueve genes usando RT-PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR), validamos el modelo y proporcionamos estimaciones del nivel de expresión promedio para cada uno.


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La competencia entre los sitios de unión determina la expresión génica a concentraciones bajas de factores de transcripción.

La respuesta de la expresión génica a las señales intra y extracelulares está mediada en gran medida por cambios en la actividad de los factores de transcripción (TF), cuyas especificidades de secuencia son ampliamente conocidas. Sin embargo, las reglas por las cuales los promotores decodifican la cantidad de TF activo en expresión génica no se comprenden bien. Aquí, medimos la actividad de 6500 promotores diseñados en seis niveles diferentes de actividad TF en levadura en ciernes. Observamos que la actividad máxima del promotor está determinada por la actividad de TF y no por el número de sitios. Sorprendentemente, la adición de un sitio de unión al activador a menudo reduce la expresión. Un modelo termodinámico que incorpora la competencia entre sitios de unión vecinos por un grupo local de moléculas de TF explica este comportamiento y predice con precisión tanto la expresión absoluta como la cantidad en la que la adición de un sitio aumenta o reduce la expresión. Tomados en conjunto, nuestros hallazgos respaldan un modelo en el que los sitios de unión vecinos interactúan de manera competitiva cuando el TF es limitante, pero por lo demás actúan de forma aditiva.

Declaración de importancia En respuesta a señales intracelulares y extracelulares, los organismos alteran la concentración y la actividad de los factores de transcripción (TF), proteínas que regulan la expresión génica. Sin embargo, no se conocen bien los mecanismos moleculares que determinan la respuesta de un promotor diana a los cambios en el número de moléculas activas de TF. Combinando modelos matemáticos con mediciones de curvas de dosis-respuesta de TF para miles de promotores diseñados, mostramos que la competencia por moléculas de TF activas es un factor importante en la determinación de la expresión génica. A concentraciones bajas de TF, los sitios de unión al activador adicionales dentro de un promotor pueden reducir realmente la expresión. El modelado termodinámico sugiere que el impedimento estérico entre los sitios de unión vecinos no puede explicar este comportamiento, pero que la competencia por las moléculas de TF limitantes sí puede.


Título: El límite de ruido bajo en la expresión génica

Las mediciones de ruido proteico se utilizan cada vez más para dilucidar los parámetros biofísicos. Desafortunadamente, los análisis de ruido a menudo están en desacuerdo con los parámetros medidos directamente. Aquí mostramos que estas inconsistencias surgen de dos opciones analíticas problemáticas: (i) la suposición de que la tasa de traducción de proteínas es invariante para diferentes proteínas de diferentes abundancias, lo que inadvertidamente ha llevado a (ii) la suposición de que un gran ruido extrínseco constitutivo establece el bajo límite de ruido en la expresión génica. Si bien la evidencia creciente sugiere que el estallido transcripcional puede establecer el límite de ruido bajo, la variabilidad en el estallido traslacional se ha ignorado en gran medida. Mostramos que la variación sistemática de todo el genoma en la eficiencia de traducción puede, y en el caso de E. coli controla el límite de ruido bajo en la expresión génica. Por lo tanto, el ruido extrínseco constitutivo es pequeño y solo juega un papel en ausencia de una variación sistemática en la eficiencia de traducción. Por último, estos resultados muestran la existencia de dos patrones de ruido de expresión distintos: (1) un piso de ruido global impuesto uniformemente a todos los genes por explosión de expresión y (2) un ruido elevado distribuido solo a un grupo selecto de genes.


Determinantes dependientes de la secuencia de la tasa de iniciación de la traducción

La velocidad general de traducción está determinada por las tasas de sus tres pasos principales: inicio, alargamiento y terminación. El paso de iniciación está regulado por una variedad de elementos estructurales y motivos de secuencia, algunos de los cuales están asociados de manera única con organismos procariotas o eucariotas (Kozak, 2005 Jackson et al, 2010). Dichos elementos estructurales en eucariotas son el casquete de 7-metilguanosina y la cola de poli (A), que mejoran sinérgicamente la eficiencia de inicio de la traducción (Gallie, 1991) mediante la circularización del ARNm, que a su vez está mediado por interacciones con factores de iniciación eucariotas. (Tarun y Sachs, 1996 Kahvejian et al, 2005). Además de una contribución del extremo 3 'del transcrito al inicio, la unión y el ensamblaje del ribosoma para una ronda de traducción se rige por la secuencia y la estructura secundaria del ARNm en las proximidades del codón de inicio. En los procariotas, la unión del ribosoma se produce en la secuencia Shine-Delgarno (SD) rica en purina (Shine y Dalgarno, 1974), ubicada unos pocos nucleótidos corriente arriba del codón de inicio, que es complementario a una secuencia cerca del extremo 3 'del ARNr 16S. (Steitz y Jakes, 1975 Jacob et al, 1987). En eucariotas, el inicio de la traducción sigue un mecanismo de exploración del ARNm por parte del ribosoma. La subunidad ribosómica 40S entra en el extremo 5 'del ARNm y migra linealmente hasta que encuentra el primer codón AUG (Kozak, 2002). El ribosoma iniciará ese primer codón AUG si está flanqueado por un motivo de secuencia corta, conocido como "secuencia de Kozak" (Kozak, 1986).

Una cuestión importante es si las diferentes variaciones en el motivo de la secuencia en la vecindad del sitio de inicio de la traducción están asociadas con, y quizás incluso determinan, la diferencia en la eficiencia de inicio de la traducción. Anteriormente se demostró que la secuencia no traducida 5 'de ARNm de levadura es rica en residuos A, y que los genes altamente expresados ​​comúnmente usan el codón UCU de serina como segundo triplete en el marco de lectura abierta (Hamilton et al, 1987). Más recientemente, utilizando datos sobre la densidad de ribosomas en todo el genoma (Ingolia et al, 2009), Robbins-Pianka et al (2010) informaron sobre la estructura secundaria predicha reducida en 5 ′ UTR, especialmente en genes de alta densidad de ribosomas en levadura. Las mediciones en todo el genoma de la ocupación y la densidad de los ribosomas en el ARNm nos permiten examinar sistemáticamente cómo la secuencia en las proximidades del sitio de iniciación puede afectar la eficiencia de la iniciación. La Figura 3 muestra un logotipo de motivo de secuencia de la secuencia que flanquea el codón de inicio AUG para dos conjuntos de S. cerevisiae genes: genes de baja ocupación de ribosomas y genes de alta ocupación de ribosomas, basados ​​en el análisis de Arava de la ocupación de ribosomas (Arava et al, 2003). Claramente, los genes de alta ocupación de ribosomas muestran un motivo con contenido de información moderado, mientras que el motivo de baja ocupación de ribosomas muestra poco o ningún consenso. Específicamente, el análisis muestra el uso preferido del nucleótido A a lo largo de las 15 posiciones cadena arriba del codón de inicio, y en particular en las posiciones -4 a -1, en genes de alta ocupación de ribosomas. Este análisis sugiere una jerarquía entre genes en el ajuste de sus secuencias 5 'UTR a un motivo de iniciación canónica, que puede determinar la eficacia de iniciación relativa de cada gen en el genoma. Además, para los genes de alta ocupación, el logotipo de la secuencia muestra un uso elevado puntiagudo de los nucleótidos C y U, en las posiciones 5 y 6 en el marco de lectura abierto. Curiosamente, la posición del segundo codón muestra valores elevados de tAI en promedio (Tuller et al, 2010a) sugiriendo una selección de alta eficiencia de traducción para la liberación y el reciclaje eficientes del iniciador tRNA de metionina. De hecho, esta señal es más pronunciada en genes con alta ocupación de ribosomas en comparación con genes con baja ocupación (H Gingold e Y Pilpel, datos no publicados, 2011).


Uso de secuenciación profunda para caracterizar el mecanismo biofísico de una secuencia reguladora transcripcional

Las células utilizan interacciones proteína-ADN y proteína-proteína para regular la transcripción. Sin embargo, la comprensión biofísica de este proceso se ha visto limitada por la falta de métodos para caracterizar cuantitativamente las interacciones que ocurren en promotores y potenciadores específicos en células vivas. Aquí mostramos cómo dicha información biofísica puede ser revelada por un experimento simple en el que una biblioteca de secuencias reguladoras parcialmente mutadas se dividen de acuerdo con sus actividades transcripcionales in vivo y luego se secuencian en masa. El análisis computacional de los datos de secuencia producidos por este experimento puede proporcionar información cuantitativa precisa sobre cómo las proteínas reguladoras en una disposición específica de sitios de unión trabajan juntas para regular la transcripción. Esta capacidad de extraer de forma fiable información precisa sobre la biofísica reguladora frente al ruido experimental es posible gracias a una relación recientemente identificada entre la probabilidad y la información mutua. Aplicando nuestras técnicas experimentales y computacionales al promotor lac de Escherichia coli, demostramos la capacidad de identificar sitios de unión de proteínas reguladoras de novo, determinar la energía de unión dependiente de la secuencia de las proteínas que se unen a estos sitios y, lo que es más importante, medir la interacción in vivo. energía entre la ARN polimerasa y un factor de transcripción unido al ADN. Nuestro enfoque proporciona un método de aplicación general para caracterizar la base biofísica de la regulación transcripcional mediante una secuencia reguladora especificada. Los principios de nuestro método también se pueden aplicar a una amplia gama de otros problemas en biología molecular.

Declaracion de conflicto de interes

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Cifras

Resumen de los experimentos. A…

Resumen de los experimentos. A ) Nosotros usamos laca promotores mutagenizados en la región ...

Huellas de información. A ) Huella ...

Huellas de información. A ) Huella de datos de peso completo, alineada con contacto conocido proteína-ADN ...

Los modelos se ajustan a los datos de peso completo.…

Los modelos se ajustan a los datos de peso completo. A ) La matriz energética CRP se ajusta a ...

Los parámetros se ajustan a los seis ...

Los parámetros se ajustan a los seis conjuntos de datos. A ) Energías de interacción CRP-RNAP ε I…


Conclusión

Las células han desarrollado distintas estrategias para combatir los límites fundamentales impuestos por las fluctuaciones intrínsecas y ambientales. Investigamos el papel de la oligomerización de proteínas en el ruido que se origina en la ocurrencia aleatoria de eventos de reacción y la naturaleza discreta de las moléculas. Los recientes esfuerzos para correlacionar la estructura de la red con los aspectos funcionales pueden proporcionar información valiosa sobre los enfoques para el control del ruido a nivel de la red [39]. Si bien la retroalimentación negativa es uno de los patrones más abundantemente observados para lograr el objetivo de estabilidad, plantea la pregunta de cómo las células cambian de manera confiable la expresión de genes de un estado a otro. El circuito de respuesta ultrasensible, ejemplificado por las omnipresentes cascadas de transducción de señales en células eucariotas, se ha propuesto como respuesta a esta pregunta [40, 41].

Además de la expansión combinatoria de la especificidad funcional, argumentamos que la disponibilidad de estados oligoméricos contribuye a la atenuación de las fluctuaciones estocásticas en la abundancia de proteínas. En los circuitos de genes autorreguladores positivos, donde la abundancia de una proteína expresada controla su propia tasa de síntesis, la dimerización proporciona un tampón que sirve para mitigar las fluctuaciones aleatorias asociadas con el proceso de transcripción-traducción en ráfagas. Encontramos que la dinámica de vinculación-desvinculación de corto tiempo reduce el nivel de ruido general al convertir el ruido de baja frecuencia potencialmente patológico en ruido de alta frecuencia sin importancia fisiológica y fácilmente atenuado [28].

La conmutación inducida por ruido generalmente indica un defecto en el procesamiento de la información celular. La salida prematura de la latencia en el sistema del fago lambda implica directamente, como consecuencia inmediata de los virus, una mayor probabilidad de ser el objetivo del sistema inmunológico del huésped. En el caso de una bacteria, la expresión de un conjunto específico de genes de captación de azúcar cuando el azúcar está ausente del medio externo es un desperdicio considerable de recursos celulares. Por ejemplo, laca operón de E. coli se puede considerar que tiene el circuito de antagonismo mutuo entre el gen lacI y los genes catabólicos de captación de lactosa [42]. Una diferencia radica en la desactivación no transcripcional del factor de transcripción alostérico LacI. LacY, lactosa permeasa, regula indirectamente LacI aumentando la absorción de lactosa, que a su vez desactiva catalíticamente LacI. Del mismo modo, también se sabe que muchos pili operones de bacterias Gram-negativas utilizan estados de expresión hereditarios, que tienen un papel crucial en la patogénesis [43, 44].

Esperamos que el cambio aleatorio de los estados de expresión génica en los ejemplos de interruptores genéticos basados ​​en retroalimentación positiva pueda muy bien estar estrechamente relacionado con la aptitud de un organismo. Los modelos fenomenológicos que relacionan la aptitud de un organismo con el cambio fenotípico aleatorio en entornos fluctuantes han proporcionado importantes conocimientos sobre el papel del ruido [45], pero aún quedan muchas preguntas sin respuesta. La aplicación de estos conocimientos al diseño de un conmutador de genes sintéticos demuestra el uso potencial de la manipulación por afinidad para la biología sintética, donde la construcción de circuitos genéticos con resistencia al ruido sintonizable es de vital importancia. En particular, nuestro análisis destaca la utilidad potencial de la heterodimerización para estabilizar interruptores ultrasensibles contra fluctuaciones aleatorias. En la práctica, se pueden emplear pequeñas moléculas de ligando para regular y sintonizar la afinidad de unión de las proteínas reguladoras, ya sean monómeros o dímeros. Nuestros resultados sugieren además que la estructura de la red de interacción proteína [33] puede proporcionar información importante sobre los métodos para el control del ruido a nivel del genoma en sistemas naturales y sintéticos.


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Ver el vídeo: Determining the Association between Target Gene Expression and Protein Expression of other Genes (Mayo 2022).


Comentarios:

  1. Gyurka

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  2. Wendell

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  3. Kazikazahn

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  5. Martinek

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