Información

18: Regulación transcripcional después del inicio - Biología

18: Regulación transcripcional después del inicio - Biología


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Aunque la regulación del inicio de la transcripción parece ser un factor dominante en el control de la expresión de muchos genes, la importancia de la regulación después del inicio se está apreciando mejor en un número y variedad de sistemas cada vez mayores. Los sistemas clásicos en los que se han explorado estos problemas son la antiterminación en el bacteriófago 1 y la atenuación de la transcripción en operones biosintéticos bacterianos, en particular los trp operón en E. coli. Aunque algunos de los detalles mecanicistas pueden ser peculiares de las bacterias, especialmente la necesidad de transcripción y traducción acopladas en el trpsistema de atenuación, el fenómeno de regulación después de la iniciación se observa en una amplia variedad de organismos, desde bacterias hasta humanos. Parte de este trabajo se discutió en las secciones sobre elongación de la transcripción en el Capítulo II de la Tercera Parte.

Introducción

Ambos sistemas analizados en este capítulo controlan la frecuencia de terminación de la transcripción. La antiterminación en el bacteriófago 1 puede evitar que la ARN polimerasa se detenga en los terminadores dependientes de r, lo que conduce a la transcripción de genes posteriores. La atenuación en el operón trp también controla la frecuencia a la que la ARN polimerasa se detiene en un terminador temprano en el operón, regulando así la transcripción de genes posteriores. A diferencia del sistema en l, la atenuación en trp regula la terminación en un terminador independiente de r.

Antiterminación en bacteriófago l

Para repasar rápidamente uno de los puntos del Capítulo III, la antiterminación ocurre en dos momentos diferentes del ciclo de vida. La proteína N permite la transcripción de lectura completa en el cambio de la transcripción inmediata-temprana a la temprana, y la proteína Q permite la transcripción de lectura completa de los genes tardíos.

Figura 4.4.1

Recuerde de la tercera parte del texto que los terminadores dependientes de r no tienen una secuencia o estructura secundaria bien conservada. Además, la proteína r rastrea las regiones libres de proteína del ARN hasta que golpea un complejo transcripcional en pausa en un sitio dependiente de r, momento en el cual su actividad ARN helicasa puede causar la terminación y disociación de la polimerasa y la transcripción del ADN molde.

Figura 4.4.2. Acción de la proteína r en los terminadores de la transcripción.

Sitios en el ADN necesarios para la antiterminación en el bacteriófago l. nuezsitios (norte Utahsitios de ilización) para pN, qutsitio para pQ y el nuezlos sitios están dentro de la unidad de transcripción, no en el promotor ni en el terminador.

  • nuezestá en la región 5 'sin traducir del nortegen, y nutRestá en la región 3 'sin traducir del crogene.
  • En ambos casos, la nuezEl sitio precede al terminador en el que actuará pN.

Figura 4.4.3. los sitios de nueces se encuentran dentro de las unidades de transcripción

Ambos nuezy nutR son secuencias de 17 pb con simetría de díadas.

5 'AGCCCTGAARAAGGGCA

TCGGGACTTYTTCCCGT 5 '

La proteína pN reconoce la nuezsitio y se une a la ARN polimerasa a medida que se transcribe a través del sitio. El complejo de pN con las ARN polimerasas es muy procesado y anula los esfuerzos de r en el terminador.

E. coli proteínas (del huésped) necesarias para la acción de pN. Estos se aislaron como funciones del huésped que, al mutar, impedían la acción de pN. NusA (codificado por nusa, por norte tutilización substancia, el grupo de complementación A) es el mejor caracterizado.

  1. Puede formar parte del complejo de transcripción.
  2. Se ha propuesto que se una al núcleo de la ARN polimerasa después de que s se disocie.
  3. También se puede unir a pN.
  4. Modelo:

NusA se une a la polimerasa central después de que s se disocia. A medida que este complejo se transcribe a través de un nuezsitio, pN también se une. El complejo a2bb'-NusA-pN evita la terminación dependiente de r en tR1, tR2, y tL1.

Figura 4.4.4.

Varios otros nusSe han identificado genes. NusG es el homólogo bacteriano de una familia de proteínas conservadas implicadas en el alargamiento. Es homólogo a la subunidad grande de DSIF, que es un factor de elongación en los mamíferos. DSIF es el factor inductor de sensibilidad a DRB. Los estudios actuales lo implican en efectos tanto negativos como positivos sobre el alargamiento. Tiene dos subunidades, una de 160 kDa que es homóloga a la proteína reguladora de la transcripción de levadura Spt5, y una de 14 kDa que es homóloga a la proteína de levadura Spt4. Otro nusgen codifica una proteína ribosomal. Es necesario aprender mucho más sobre la terminación y la antiterminación. los nusEl fenotipo de mutaciones en un gen que codifica una proteína ribosómica sugiere que la traducción también está acoplada a este proceso.

Componentes del E. coli trp operón

los trpoperón codifica las enzimas necesarias para biosíntesis de triptófano. Más específicamente, sus cinco genes (trpEDCBA) codifican cinco subunidades de proteínas que en total catalizan cinco pasos enzimáticos, convertir el ácido corísmico en triptófano. Sin embargo, hay no es una correspondencia 1: 1 entre un cistrón y una enzima. Por ejemplo, trpBy trpAcodifican, respectivamente, las subunidades by a de la triptófano sintasa, que cataliza el reemplazo de glicerol-3-fosfato de indol-3-glicerol-fosfato por serina para formar triptófano, con gliceraldehído-3-fosfato como el otro producto

Figura 4.4.5.

A líder La secuencia separa el promotor y el operador del primer gen estructural del operón, trpe. Un atenuador de transcripción sigue al líder. Como veremos con más detalle a continuación, la eficacia de la terminación "prematura" en este atenuador está determinada por el grado de traducción del líder, que a su vez está determinado por la disponibilidad de Trp-tRNAtrp. Ésta es una parte importante de la regulación del operón. Dos terminadores de transcripción siguen los genes estructurales, uno dependiente de r y otro independiente de r.

Modos de regulación: apagar el operón en presencia de Trp

Operador-represor: requiere una proteína que se une a un sitio específico en presencia de Trp para disminuir la eficiencia de inicio de la transcripción. Atenuación: el alargamiento (y terminación) de la transcripción por la ARN polimerasa está vinculado al progreso de la traducción por un ribosoma. En presencia de Trp, la traducción del ribosoma hace que termine la transcripción de los genes posteriores en el operón.

Represor: apo-represor y co-represor (Trp)

los apo-represor está codificado por trpRen un lugar distante. El apo-represor es un homo-tetramer. Tiene una alta afinidad por el operador solo cuando está limitado por el aminoácido Trp, que actúa como correpresor. Por tanto, el represor activo es un tetrámero de (anteriormente apo-) represor en complejo con Trp. El represor activo se une al operador para evitar el inicio de la transcripción. los el operador se superpone al promotor, incluida la región -10 del promotor. Tiene un eje de simetría díada.

Figura 4.4.6.

Atenuación

El atenuador es un terminador transcripcional condicional utilizado para regular la expresión de operones biosintéticos en bacterias. Está aguas arriba de los genes estructurales. trpEDCBA y es un sitio de terminación independiente de r. Su capacidad para terminar la transcripción depende de su capacidad para formar el tallo del ARN dúplex que es característico de los sitios de terminación independientes de r.

Figura 4.4.7

La fracción de transcripciones que se leen a través del atenuador está determinada por [Trp-tRNAtrp]. La concentración de ARNt cargados es una medida de la cantidad de Trp disponible para la síntesis de proteínas. Si la mayor parte de tRNAtrp está cargada, hay una abundancia de Trp y la célula no necesita producir más. Bajo [Trp-tRNAtrp] permite la transcripción de lectura a través del atenuador, de modo que trpEDCBA se expresa y una [Trp-tRNAtrp] alta provoca la terminación de la transcripción en el atenuador.

El [Trp-tRNAtrp] determina el progreso de los ribosomas a medida que traducen un péptido líder corto. El péptido líder es un polipéptido corto de 14 aminoácidos codificado por trpL. Dos codones para Trp están en el líder, y el progreso de los ribosomas más allá de estos codones Trp estará determinado por la disponibilidad de Trp-tRNAtrp. Cuando la concentración de triptófanil-tRNA es alta, la traducción del trpse completará el líder, pero cuando sea bajo, la traducción se detendrá en los codones de triptófano.

El grado de progreso de los ribosomas determina las estructuras secundarias formadas en el ARN líder. Cuando el [Trp-tRNAtrp] es alto, los ribosomas se trasladan más allá de los codones Trp para completar la síntesis líder del péptido. Esto permite que el ARN naciente forme la estructura del terminador independiente de r. Por lo tanto, la transcripción termina antes de que la ARN polimerasa alcance trpEDCBA. Cuando la [Trp-tRNAtrp] es baja, los ribosomas se detienen en los codones Trp, lo que evita la formación de las estructuras secundarias en el ARN necesarias para la terminación en el atenuador. Por lo tanto, la transcripción de lectura continua a través de trpEDCBAy se expresa el operón, de modo que se produce más Trp.

Tabla 4.4.1: Los componentes básicos de la regulación en el atenuador del trpoperón de E. coli se tabulan a continuación.
[trp-tRNA]traducción de trpLestructuras secundarias formadas en ARNAtenuadorOperón
Elevadocompleto3-4 talloterminar la transcripciónAPAGADO
Bajose detiene en los codones Trp2-3 tallopermitir la transcripción de lectura completaSOBRE

Estructuras alternativas de pares de bases en el ARN líder. Cuatro regiones del ARN líder pueden estar implicadas en la formación de estructuras secundarias, en particular tallos con pares de bases; estos se denominan simplemente regiones 1, 2, 3 y 4. Potencialmente, 1 puede emparejarse con 2, 2 puede emparejarse con 3 y 3 puede emparejarse con 4.

Figura 4.4.8

Un tallo formado por emparejamiento entre 3 y 4 produce un tallo rico en G + C seguido de U, que es suficiente para la terminación de la transcripción independiente de r. Cuando la [Trp-tRNAtrp] es alta, se forma la estructura de 3-4 pares de bases y la transcripción termina en el atenuador. Esto apaga el operón. La formación de un tallo de pares de bases entre las regiones 2 y 3 impide la formación del terminador 3-4, y la transcripción continuará en los genes estructurales. trpEDCBA. Esto enciende el operón.

Figura 4.4.9

La elección entre un tallo 2-3 o un tallo 3-4 viene dictada por el progreso del ribosoma. Si el ribosoma puede traducir más allá de los codones Trp (cuando el [Trp-tRNAtrp] es alto), entonces alcanzará un codón de terminación de traducción natural. Cuando el ribosoma está en esa posición, la región 2 del ARN líder está cubierta por el ribosoma, por lo que no se puede formar el tallo 2-3, pero sí el tallo 3-4. Esto genera la estructura secundaria necesaria para la terminación de la transcripción en el atenuador. Por el contrario, si el ribosoma se detiene en los codones Trp en el líder, porque el [Trp-tRNAtrp] es bajo, entonces la región 2 del ARN líder no está cubierta por el ribosoma. A continuación, puede emparejarse de bases con la región 3. Esto evita la formación del terminador 3-4, y la ARN polimerasa puede continuar el alargamiento a través de trpEDCBA.

Análisis mutacional (ejemplos seleccionados)

  • Traducción de trpLes necesario para la regulación por atenuación. La mutación del AUG para el inicio de la traducción del ARN líder evita la transcripción más allá del atenuador. En ausencia de traducción, se pueden formar tanto los tallos 1-2 como los 3-4. El último tallo 3-4 es el terminador.
  • Se requiere tRNAtrp cargado para la regulación. La mutación de los genes para tRNAtrp o Trp-tRNAtrp sintetasa conduce a la expresión constitutiva de trpEDCBA. En estos mutantes, la traducción se detendrá en los codones Trp independientemente de la [Trp] intracelular, y no se formará ningún terminador en el atenuador.
  • Estructuras secundarias específicas en el trpEl ARN líder es necesario para la regulación. P.ej. las mutaciones que disminuyen el número de pares de bases entre las regiones 3 y 4 disminuirán la cantidad de terminación transcripcional (es decir, aumentarán la expresión del operón). Las mutaciones compensatorias que aumentan el número de pares de bases entre 3 y 4 suprimirán las mutaciones originales.

La atenuación requiere transcripción y traducción acopladas

No requiere proteínas reguladoras: la carga del ARNt afín es la señal reguladora. Necesita un sitio de pausa transcripcional en +90 para permitir que los ribosomas se pongan al día con la ARN polimerasa y, por lo tanto, afecten a las estructuras secundarias en el ARN naciente.

La atenuación es un mecanismo común para regular los operones biosintéticos.

Muchos operones que codifican las enzimas que catalizan la biosíntesis de aminoácidos están regulados por atenuación. En cada caso, el polipéptido líder es rico en el aminoácido que es el producto de la ruta, p. his, phe, leu, thr, ilv.

Lecturas adicionales

  • Friedman, D.I. y Count, D.L. (1995) Antiterminación transcripcional: El paradigma lambda actualizado. Microbiología molecular 18: 191-200.
  • Henkin, T. (2000) Terminación transcripcional en bacterias. Opiniones actuales en microbiología 3: 149-153.
  • Gusarov, I. y Nudler, E. (2001) Control de la terminación transcripcional intrínseca por N y NusA: El mecanismo básico. Celda 107: 437-449.

Transcripción (biología)

Transcripción es el proceso de copiar un segmento de ADN en ARN. Se dice que los segmentos de ADN transcritos en moléculas de ARN que pueden codificar proteínas producen ARN mensajero (ARNm). Otros segmentos de ADN se copian en moléculas de ARN llamadas ARN no codificantes (ncRNA). Promedio sobre múltiples tipos de células en un tejido dado, la cantidad de mRNA es más de 10 veces la cantidad de ncRNA (aunque, en particular, los ncRNA de tipos de células individuales pueden superar a los mRNA). [1] La preponderancia general de ARNm en las células es válida aunque menos del 2% del genoma humano se puede transcribir en ARNm (genoma humano # codificante frente a ADN no codificante), mientras que al menos el 80% del ADN genómico de mamíferos puede ser activo transcrito (en uno o más tipos de células), y la mayoría de este 80% se considera ncRNA. [2]

Tanto el ADN como el ARN son ácidos nucleicos, que utilizan pares de bases de nucleótidos como lenguaje complementario. Durante la transcripción, una ARN polimerasa lee una secuencia de ADN, que produce una hebra de ARN complementaria y antiparalela denominada transcripción primaria.

La transcripción procede en los siguientes pasos generales:

  1. La ARN polimerasa, junto con uno o más factores de transcripción generales, se une al ADN promotor.
  2. La ARN polimerasa genera una burbuja de transcripción que separa las dos hebras de la hélice de ADN. Esto se hace rompiendo los enlaces de hidrógeno entre los nucleótidos de ADN complementarios.
  3. La ARN polimerasa agrega nucleótidos de ARN (que son complementarios a los nucleótidos de una hebra de ADN).
  4. El esqueleto de ARN azúcar-fosfato se forma con la ayuda de la ARN polimerasa para formar una cadena de ARN.
  5. Los enlaces de hidrógeno de la hélice ARN-ADN se rompen, liberando la cadena de ARN recién sintetizada.
  6. Si la célula tiene un núcleo, el ARN puede procesarse más. Esto puede incluir poliadenilación, taponado y empalme.
  7. El ARN puede permanecer en el núcleo o salir al citoplasma a través del complejo de poros nucleares.

Si el tramo de ADN se transcribe en una molécula de ARN que codifica una proteína, el ARN se denomina ARN mensajero (ARNm) y el ARNm, a su vez, sirve como molde para la síntesis de la proteína a través de la traducción. Otros tramos de ADN se pueden transcribir en pequeños ARN no codificantes, como microARN, ARN de transferencia (ARNt), ARN nucleolar pequeño (ARNsno), ARN nuclear pequeño (ARNnn) o moléculas de ARN enzimático llamadas ribozimas [3], así como moléculas más grandes ARN no codificantes, como ARN ribosómico (ARNr) y ARN largo no codificante (ARNlnc). En general, el ARN ayuda a sintetizar, regular y procesar proteínas, por lo que desempeña un papel fundamental en el desempeño de funciones dentro de una célula.

En virología, el término transcripción también puede usarse cuando se hace referencia a la síntesis de ARNm a partir de una molécula de ARN (es decir, equivalente a la replicación de ARN). Por ejemplo, el genoma de un virus de ARN monocatenario de sentido negativo (ssRNA -) puede ser una plantilla para un ARN monocatenario de sentido positivo (ssRNA +) [ aclaración necesaria ]. Esto se debe a que la cadena de sentido positivo contiene la información de secuencia necesaria para traducir las proteínas virales necesarias para la replicación viral. Este proceso está catalizado por una replicasa de ARN viral. [4] [ aclaración necesaria ]


Fondo

La transcripción genética es un proceso de varios pasos que consiste en el reclutamiento de la ARN polimerasa II (Pol II) a los promotores, el inicio, elongación y la terminación de la transcripción. Además de producir polímeros de ARN basados ​​en la plantilla de ADN, la holoenzima Pol II también regula numerosos eventos de procesamiento de ARN, incluida la formación del casquete 5 ', el empalme, la poliadenilación y el transporte de ARN [1-7].

Si bien históricamente la mayoría de los estudios se centraron en comprender cómo se regulan la unión del promotor y el inicio de la transcripción, estudios recientes han demostrado que las etapas adicionales del proceso de transcripción también están estrictamente reguladas y son críticas para la activación de genes. Estos estudios han demostrado que la unión de Pol II a promotores de genes no es suficiente para una transcripción productiva. En cambio, en la mayoría de los genes, Pol II está parcialmente 'pausado' de 20 a 60 nt desde el sitio de inicio de la transcripción (TSS), y se necesitan varios pasos regulados para que Pol II se aparte del TSS y transcriba el resto del gen. [8-15].

La tasa de movimiento de Pol II a través de los cuerpos génicos también se ha relacionado con varios aspectos del procesamiento del ARN cotranscripcional. Por ejemplo, los cambios en las tasas de elongación de la transcripción pueden afectar el resultado de la maquinaria de empalme [7, 16, 17], y se demostró que el alargamiento lento de Pol II mejora la inclusión de exones débiles específicos [7] en apoyo de esta noción, Pol Se encontró que II se acumulaba en los exones [18-20]. Asimismo, la tasa de alargamiento de Pol II se ha relacionado con la regulación de la poliadenilación alternativa [21], de hecho, Pol II se acumula en los sitios de poliadenilación [9].

La importancia de los pasos posteriores al inicio de la transcripción también se subraya por el impacto de la mala regulación de estos pasos en la viabilidad celular y del organismo. Por ejemplo, muchos de los socios de translocación del gen MLL, que se cree que impulsan la leucemia aguda agresiva, son parte del complejo de superelongación (SEC). Las proteínas de fusión MLL asociadas a la leucemia relocalizan el SEC a los genes diana MLL, evitando el control transcripcional normal y causando una expresión aberrante de esos genes [22]. De manera similar, se sugirió que el exceso de c-Myc aumenta la expresión génica al aumentar la liberación de Pol II en pausa y, por lo tanto, facilita la elongación activa, aliviando así las limitaciones que limitan la tasa de crecimiento y proliferación de las células tumorales [23]. Además, los virus utilizan o modifican los procesos relacionados con el alargamiento de la transcripción en su beneficio. Por ejemplo, la proteína NS1 de la influenza A comprende una secuencia similar a una histona que puede dirigirse al complejo de elongación PAF1, lo que permite la modulación selectiva de la expresión génica de la célula huésped y contribuye a la supresión de la respuesta antiviral [24].Además, durante la infección activa por VIH-1, el transactivador de transcripción viral (Tat) recluta la SEC para la repetición terminal larga (LTR) del VIH-1 para activar la expresión del provirus en las células huésped [25-27]. Por lo tanto, una mejor aclaración de la regulación de la elongación transcripcional podría contribuir a la comprensión de los mecanismos moleculares de la enfermedad e incluso sugerir nuevos enfoques terapéuticos.

A pesar de los vínculos documentados entre las tasas de elongación y numerosas funciones relacionadas con el ARN, las tasas reales de elongación dentro de las células siguen siendo objeto de debate, con valores informados que oscilan entre 1 kilobase por minuto (Kb / min) y 6 Kb / min [28]. En la mayoría de los casos, se midieron las tasas de elongación de solo unos pocos genes a la vez. Un estudio, utilizando la secuenciación Global Run-On (GRO-seq), pudo determinar las tasas de aproximadamente 166 genes largos regulados positivamente en respuesta a un tratamiento corto con fisiológicos. , inductores no tóxicos [29]. Dado que las tasas de elongación de genes individuales pueden alterarse de manera dependiente del estímulo [29], es importante medir las tasas de elongación de genes no estimulados para obtener una comprensión más general de la relación entre las tasas de elongación de la transcripción basal y la Estado de procesamiento de ARN y expresión génica. Además, la evaluación de un gran número de genes puede proporcionar información más definitiva sobre los factores que afectan las tasas de elongación de la transcripción. Aquí describimos un método que permite medir fácilmente de forma simultánea, en un solo experimento, las tasas de elongación en estado estacionario de miles de genes dentro de las células vivas.


Secuencias reguladoras de acción cis: promotores y potenciadores

Como ya se ha comentado, la transcripción en bacterias está regulada por la unión de proteínas a cis-secuencias de acción (por ejemplo, el laca operador) que controlan la transcripción de genes adyacentes. Similar cisLas secuencias que actúan regulan la expresión de genes eucariotas. Estas secuencias se han identificado en células de mamíferos en gran parte mediante el uso de ensayos de transferencia de genes para estudiar la actividad de las regiones reguladoras sospechosas de genes clonados (Figura 6.18). Las secuencias reguladoras eucariotas se ligan habitualmente a un gen indicador que codifica una enzima fácilmente detectable. La expresión del gen indicador después de su transferencia a células cultivadas proporciona entonces un ensayo sensible para la capacidad de las secuencias reguladoras clonadas para dirigir la transcripción. Por tanto, se pueden identificar regiones reguladoras biológicamente activas, y in vitro La mutagénesis se puede utilizar para determinar las funciones de secuencias específicas dentro de la región.

Figura 6.18

Identificación de secuencias reguladoras eucariotas. La secuencia reguladora de un gen eucariota clonado se liga a un gen indicador que codifica una enzima fácilmente detectable. El plásmido resultante se introduce luego en células receptoras cultivadas mediante transfección. (más. )

Los genes transcritos por la ARN polimerasa II tienen dos elementos promotores centrales, la caja TATA y la secuencia Inr, que sirven como sitios de unión específicos para factores de transcripción generales. Otro cisLas secuencias que actúan sirven como sitios de unión para una amplia variedad de factores reguladores que controlan la expresión de genes individuales. Estas cisLas secuencias reguladoras que actúan se encuentran con frecuencia, aunque no siempre, aguas arriba de la caja TATA. Por ejemplo, se identificaron dos secuencias reguladoras que se encuentran en muchos genes eucariotas mediante estudios del promotor del gen del virus del herpes simple que codifica la timidina quinasa (Figura 6.19). Ambas secuencias están ubicadas dentro de 100 pares de bases corriente arriba de la caja TATA: sus secuencias de consenso son CCAAT y GGGCGG (llamada caja GC). Desde entonces se han identificado proteínas específicas que se unen a estas secuencias y estimulan la transcripción.

Figura 6.19

Un promotor eucariota. El promotor del gen de la timidina quinasa del virus del herpes simple contiene tres elementos de secuencia aguas arriba de la caja TATA que se requieren para una transcripción eficiente: una caja CCAAT y dos cajas GC (secuencia consenso GGGCGG). (más. )

En contraste con la organización relativamente simple de las cajas CCAAT y GC en el promotor de la timidina quinasa del herpes, muchos genes en células de mamíferos están controlados por secuencias reguladoras ubicadas más lejos (a veces más de 10 kilobases) del sitio de inicio de la transcripción. Estas secuencias, llamadas potenciadoras, fueron identificadas por primera vez por Walter Schaffner en 1981 durante estudios del promotor de otro virus, SV40 (Figura 6.20). Además de una caja TATA y un conjunto de seis cajas GC, se requieren dos repeticiones de 72 pares de bases ubicadas más arriba para una transcripción eficiente de este promotor. Se encontró que estas secuencias estimulaban la transcripción de otros promotores así como de SV40 y, sorprendentemente, su actividad no dependía ni de su distancia ni de su orientación con respecto al sitio de inicio de la transcripción (Figura 6.21). Podrían estimular la transcripción cuando se colocan corriente arriba o corriente abajo del promotor, en una orientación hacia adelante o hacia atrás.

Figura 6.20

El potenciador SV40. El promotor SV40 para la expresión génica temprana contiene una caja TATA y seis cajas GC dispuestas en tres conjuntos de secuencias repetidas. Además, la transcripción eficaz requiere un potenciador aguas arriba que consta de dos repeticiones de 72 pares de bases (pb). (más. )

Figura 6.21

Acción de potenciadores. Sin un potenciador, el gen se transcribe a un nivel basal bajo (A). La adición de un potenciador, E & # x02014, por ejemplo, el SV40 de 72 pares de bases repite & # x02014 estimula la transcripción. El potenciador está activo no solo cuando se coloca solo (más.)

La capacidad de los potenciadores para funcionar incluso cuando están separados por grandes distancias de los sitios de inicio de la transcripción al principio sugirió que funcionan mediante mecanismos diferentes a los de los promotores. Sin embargo, este no ha sido el caso: los potenciadores, como los promotores, funcionan uniendo factores de transcripción que luego regulan la ARN polimerasa. Esto es posible debido al bucle de ADN, que permite que un factor de transcripción unido a un potenciador distante interactúe con la ARN polimerasa o factores de transcripción generales en el promotor (Figura 6.22). Los factores de transcripción unidos a potenciadores distantes pueden, por tanto, funcionar mediante los mismos mecanismos que los unidos adyacentes a los promotores, por lo que no existe una diferencia fundamental entre las acciones de los potenciadores y las de los potenciadores. cis-secuencias reguladoras que actúan adyacentes a los sitios de inicio de la transcripción. Curiosamente, aunque los potenciadores se identificaron por primera vez en células de mamíferos, posteriormente se han encontrado en bacterias, un caso inusual en el que los estudios de eucariotas sirvieron como modelo para los sistemas procariotas más simples.

Figura 6.22

Bucle de ADN. Los factores de transcripción unidos a potenciadores distantes pueden interactuar con los factores de transcripción generales en el promotor porque el ADN que interviene puede formar bucles. Por tanto, no existe una diferencia fundamental entre la acción de la transcripción (más.)

La unión de proteínas reguladoras transcripcionales específicas a potenciadores es responsable del control de la expresión génica durante el desarrollo y la diferenciación, así como durante la respuesta de las células a las hormonas y factores de crecimiento. Uno de los potenciadores de mamíferos más estudiados controla la transcripción de genes de inmunoglobulina en linfocitos B. Los experimentos de transferencia de genes han establecido que el potenciador de inmunoglobulina es activo en los linfocitos, pero no en otros tipos de células. Por tanto, esta secuencia reguladora es al menos parcialmente responsable de la expresión específica de tejido de los genes de inmunoglobulina en el tipo celular diferenciado apropiado.

Un aspecto importante de los potenciadores es que normalmente contienen múltiples elementos de secuencia funcional que se unen a diferentes proteínas reguladoras de la transcripción. Estas proteínas trabajan juntas para regular la expresión génica. El potenciador de la cadena pesada de inmunoglobulina, por ejemplo, abarca aproximadamente 200 pares de bases y contiene al menos nueve elementos de secuencia distintos que sirven como sitios de unión a proteínas (Figura 6.23). La mutación de cualquiera de estas secuencias reduce pero no anula la actividad potenciadora, lo que indica que las funciones de las proteínas individuales que se unen al potenciador son al menos parcialmente redundantes. Muchos de los elementos de la secuencia individual del potenciador de inmunoglobulina estimulan por sí mismos la transcripción en células no linfoides. Por tanto, la actividad restringida del potenciador intacto en los linfocitos B no es el resultado de la función específica del tejido de cada uno de sus componentes. En cambio, la expresión específica de tejido resulta de la combinación de los elementos de secuencia individuales que componen el potenciador completo. Estos elementos incluyen algunos cis-actúan secuencias reguladoras que se unen a activadores transcripcionales que se expresan específicamente en linfocitos B, así como a otras secuencias reguladoras que se unen a represores en células no linfoides. Por tanto, el potenciador de inmunoglobulina contiene elementos reguladores negativos que inhiben la transcripción en tipos celulares inapropiados, así como elementos reguladores positivos que activan la transcripción en linfocitos B. La actividad general del potenciador es mayor que la suma de sus partes, lo que refleja la acción combinada de las proteínas asociadas con cada uno de sus elementos de secuencia individuales.

Figura 6.23

El potenciador de inmunoglobulinas. El potenciador de la cadena pesada de inmunoglobulina abarca aproximadamente 200 bases y contiene nueve elementos de secuencia funcional (E, & # x003bcE1-5, & # x003c0, & # x003bcB y OCT), que juntos estimulan la transcripción en los linfocitos B.


DISCUSIÓN

Hemos demostrado previamente que CLN3 Los niveles de ARNm están regulados por una fuente de carbono y esa inducción de glucosa de CLN3 la transcripción no depende ni del crecimiento celular ni de la progresión a través del ciclo celular (19). Mediante el uso CLN3 construcciones de fusión promotor-informador, hemos identificado una región entre las posiciones & # x02212762 y & # x02212414 en el CLN3 promotor que puede conferir regulación de glucosa a un gen indicador heterólogo. Esta región dentro del CLN3 El promotor contiene cinco copias, cuatro exactas y una parcial, de la secuencia AAGAAAAA. Los oligonucleótidos bicatenarios pequeños que contienen estas secuencias repetidas pueden impulsar la expresión dependiente de glucosa del gen indicador. Las mutaciones en estos elementos reducen sustancialmente la inducción transcripcional de un URA3 reportero y el CLN3 gen por glucosa. Los ensayos de cambio de movilidad demuestran la unión específica de proteínas de extractos de levadura a fragmentos de ADN que contienen las repeticiones. La unión de proteínas al oligonucleótido marcado puede competir con un exceso molar de oligonucleótidos no marcados que contienen las secuencias repetidas anteriores, pero la mutación de los G & # x02019 centrales dentro de las repeticiones disminuye la capacidad de competir del ADN no marcado. Estos resultados indican la importancia de los elementos repetidos tanto para la inducción de la transcripción como para las interacciones ADN-proteína. La transferencia Southwestern reveló una proteína con un tamaño aparente de 69 kDa que se une específicamente a estas secuencias de una manera que depende de las repeticiones intactas, así como una proteína más pequeña que se une de una manera que no se ve afectada por cambios en las repeticiones.

No hemos encontrado evidencia que indique que la glucosa regule la unión de proteínas a elementos del CLN3 promotor que confiere capacidad de respuesta a la glucosa. Esto sugiere que la regulación de la glucosa de CLN3 implica un proceso que es más complejo que la simple unión regulada de un transactivador, o proteína represora, a la CLN3 promotor. Un paso importante para aprender cómo afecta la glucosa CLN3 expresión sería identificar la (s) proteína (s) que se une a los elementos sensibles a la glucosa en el CLN3 promotor. Sería interesante saber cómo afecta la glucosa a estas proteínas. Otra cuestión importante es si estos factores son específicos de CLN3 expresión o son parte de una vía común que coordina la expresión de un gran grupo de genes en respuesta a la glucosa. En este sentido, una búsqueda en la base de datos arrojó solo unos pocos promotores de levadura que llevaban estos elementos repetidos. Estos genes no pertenecen a ningún grupo obvio en términos de función, ni todos parecen estar regulados transcripcionalmente por la glucosa. Por lo tanto, no podemos decir si las características que regulan la transcripción de CLN3 son importantes en la regulación de otros genes.

Mutación de solo cinco bases, confinada a A2Georgia5 se repite dentro del CLN3 promotor, produce células que no aumentan adecuadamente los niveles de Cln3 en respuesta a la glucosa. Esta respuesta de disminución tiene claramente un significado funcional, porque en medio de glucosa, estas células se vuelven aproximadamente dos veces más grandes que los controles que expresan CLN3 del promotor de tipo salvaje. No pudimos detectar una cantidad apreciable de proteína Cln3 en las células TKL1, sin embargo, creemos que la proteína Cln3 se expresa en estas células, porque parecen más pequeñas que las células con CLN3 completamente eliminado. El plásmido de copia única produjo niveles de proteína Cln3 que, en nuestro estudio, estaban cerca del límite de detección. Proponemos que las células TKL1 tienen algún nivel de proteína Cln3 funcional que es demasiado bajo para dar una señal en nuestros experimentos. Si bien está claro que estos elementos contribuyen a la respuesta a la glucosa, es igualmente claro que estos elementos por sí solos no explican por sí mismos el acortamiento del ciclo celular que produce la glucosa. En primer lugar, mientras que la mutación de los cinco A2Georgia5 repite disminuyó la capacidad de la glucosa para aumentar CLN3 niveles de ARNm, esto no anuló completamente la respuesta. Esto puede deberse a que otros elementos o mecanismos que no involucran estas secuencias repetidas siguen siendo capaces de aumentar CLN3 niveles de transcripción en respuesta a la glucosa. También es posible que la respuesta restante se deba a la presencia de copias imperfectas adicionales de la secuencia repetida. Si bien nos hemos centrado en el A de 8 pb2Georgia5 secuencias, hay un total de 13 copias de la secuencia AAGAAA de 6 pb más corta dentro de las 1000 bases CLN3 secuencia de codificación. Es posible que estos también contribuyan a la respuesta de la glucosa. En segundo lugar, los niveles de proteína Cln3 se regulan en una variedad de niveles además de la transcripción en respuesta a las señales de nutrientes. Estos mecanismos incluyen la regulación postranscripcional por medio rico (20), la vía Ras-AMP cíclico (10), las tasas de síntesis de proteínas (10) y la limitación de nitrógeno (8). Finalmente, el CLN3 Se cree que el gen actúa en una vía redundante, en esa deleción de CLN3 solo es letal en combinación con la pérdida de otros genes, en particular, BCK2 (4, 7). Parece probable que los nutrientes regulen otros componentes del ciclo celular además de CLN3.

Los homólogos de mamíferos más cercanos a Cln3 parecen ser las ciclinas de tipo D. Tanto las ciclinas de tipo D como CLN3 tienen similitudes en la expresión, se ven menos afectados por la posición del ciclo celular que otras ciclinas, y ambos tipos de ciclina parecen funcionar en el proceso de terminar G1. Las ciclinas D sirven para vincular las señales mitogénicas del entorno celular al proceso de salida de G1 (22). Al igual que con las ciclinas D, los niveles de Cln3 parecen estar regulados por señales ambientales, en este caso provenientes de recursos nutritivos. La regulación transcripcional de CLN3 que describimos parece ser sólo una de las múltiples capas de control que permiten a las células de levadura modular G1 largo.


Trabajando con Genética Molecular

Este libro de texto en línea cubre los principales temas de genética molecular en un enfoque basado en problemas. Surgió de la enseñanza de un curso para estudiantes universitarios de nivel superior y estudiantes graduados en la Universidad Estatal de Pensilvania (BMB400).

Los derechos de autor pertenecen al autor, Ross C. Hardison. Cualquiera es libre de leer y usar esta información para cualquier propósito, EXCEPTO con fines de lucro. Lo hago disponible gratuitamente, así que mantenlo gratis. Por ejemplo, si está enseñando una clase y desea señalarla a los estudiantes, hágalo. Si desea utilizar este material para aprender algo de genética molecular, hágalo. Si desea utilizar algunas de las cifras en un informe, hágalo, solo enumere esta página como su fuente. Si desea tomar parte o todo este material y publicarlo como un libro para su beneficio, ¡NO LO HAGA!

El material estaba actualizado en el otoño de 2002. La mayor parte del material es relativamente "estable", por lo que es de esperar que sea útil durante algún tiempo. No tengo la intención de actualizarlo muy a menudo, si es que lo hago. Sin embargo, los comentarios siempre son bienvenidos y pueden inspirarme a editar esto un poco más.

Varios conferenciantes invitados han agregado material importante a este curso y libro. En particular, agradezco a Tracy Nixon (Dept. BMB, PSU) por sus contribuciones al Capítulo 16 y a Jerry Workman (anteriormente en BMB en PSU, ahora en el Stowers Institute) por sus contribuciones al Capítulo 20. Algunas de las imágenes se derivan de otras libros, artículos y sitios web. He tratado de citar todas esas fuentes, por favor, perdóneme si he pasado por alto alguna.

Puede acceder a las versiones html y pdf de los capítulos. Los archivos PDF son representaciones más precisas, pero se proporciona HTML para mayor comodidad. El material original se generó en Microsoft Word, y el html es generado por la función de conversión "Word a html" dentro de Word. Sé que algunas cosas (como flechas, exponentes e incluso posiciones de figuras con respecto al texto) no se representan con precisión, así que tenga cuidado con este problema. Algunas de las imágenes se hicieron hace años en MacDraw (archivos pict) y no se representan tan bien. Un pequeño número está dibujado a mano y escaneado en estos son difíciles de leer. Sin embargo, la mayoría de las figuras deben ser legibles, especialmente en los archivos PDF.


¡Descargar ahora!

Le facilitamos la búsqueda de libros electrónicos en PDF sin tener que buscar. Y al tener acceso a nuestros libros electrónicos en línea o al almacenarlos en su computadora, tiene respuestas convenientes con Campbell Biology Chapter 18 Test Pdf. Para comenzar a encontrar Campbell Biology Chapter 18 Test Pdf, tiene razón en encontrar nuestro sitio web que tiene una colección completa de manuales enumerados.
Nuestra biblioteca es la más grande de estas que tiene literalmente cientos de miles de productos diferentes representados.

Finalmente recibí este libro electrónico, ¡gracias por todos estos PDF de prueba del Capítulo 18 de Campbell Biology que puedo obtener ahora!

No pensé que esto funcionaría, mi mejor amigo me mostró este sitio web, ¡y funciona! Obtengo mi eBook más buscado

¡¿Qué es este gran libro electrónico gratis ?!

¡Mis amigos están tan enojados que no saben cómo tengo todos los libros electrónicos de alta calidad que ellos no saben!

Es muy fácil obtener libros electrónicos de calidad)

tantos sitios falsos. este es el primero que funcionó! Muchas gracias

wtffff no entiendo esto!

Simplemente seleccione su botón de clic y luego descargar, y complete una oferta para comenzar a descargar el libro electrónico. Si hay una encuesta, solo toma 5 minutos, pruebe cualquier encuesta que funcione para usted.


Resultados

Marcas epigenéticas asociadas a potenciadores en el Ikzf1 DHS específico de linfoides

Mapeo de grupos de DHS específicos de linfoides en el Ikzf1 locus ha identificado previamente 10 supuestas regiones reguladoras 16 (Figura 1).La mayoría de estos sitios también se identificaron recientemente mediante el mapeo de DHS en todo el genoma en timocitos, esplenocitos y células B generadas por el proyecto ENCODE 20 (Figura 1 suplementaria, Tablas suplementarias 6 y 8). En las proximidades de estos sitios de DHS había regiones de extensa conservación entre el ratón y el ser humano. Ikzf1 (IKZF1). Se identificaron siete regiones conservadas intrónicas (p, D, E, F, G, H e I) y 1 aguas arriba (J), y 5 (DH) se ubicaron dentro del intrón de ∼40-kb entre los exones 3 y 4 (& gt86 % Tabla 1 Figura 1).

Demarcación epigenética de Ikzf1 Regiones reguladoras. La ubicación de los 10 grupos de DHS específicos de linfoides descritos anteriormente 16 y las regiones no codificantes con una extensa conservación de la secuencia de ratón-humano se muestran en la Ikzf1 lugar. Los grupos de DHS y DHS individuales se indican mediante barras verticales cortas o barras rojas. Sobre el Ikzf1 locus, los exones 1a y 1b no traducidos asociados con distintas actividades promotoras se indican como rectángulos sin relleno y los 7 exones 2 a 8 traducidos como rectángulos sólidos. Picos de enriquecimiento para las modificaciones de la histona H3 (H3K4me1, me2, me3, H3K9 / 14Ac y H3K36me3) y para las formas de iniciación (8WG16) y elongación (S5, S2) de RNA Pol II (pII) en el Ikzf1 locus se muestran en Integrative Genomics Viewer (IGV) 2.1 utilizando la base de datos del genoma del ratón mm9. Los picos de enriquecimiento para H3K27Ac y p300 se dedujeron de los datos de ENCODE (Tabla complementaria 8). 20

Demarcación epigenética de Ikzf1 Regiones reguladoras. La ubicación de los 10 grupos de DHS específicos de linfoides descritos anteriormente 16 y las regiones no codificantes con una extensa conservación de la secuencia de ratón-humano se muestran en la Ikzf1 lugar. Los grupos de DHS y DHS individuales se indican mediante barras verticales cortas o barras rojas. Sobre el Ikzf1 locus, los exones 1a y 1b no traducidos asociados con distintas actividades promotoras se indican como rectángulos sin relleno y los 7 exones 2 a 8 traducidos como rectángulos sólidos. Picos de enriquecimiento para las modificaciones de la histona H3 (H3K4me1, me2, me3, H3K9 / 14Ac y H3K36me3) y para las formas de iniciación (8WG16) y elongación (S5, S2) de RNA Pol II (pII) en la Ikzf1 locus se muestran en Integrative Genomics Viewer (IGV) 2.1 utilizando la base de datos del genoma del ratón mm9. Los picos de enriquecimiento para H3K27Ac y p300 se dedujeron de los datos de ENCODE (Tabla complementaria 8). 20

Conocer los tipos de elementos regulatorios asociados con la Ikzf1 DHS conservados, el entorno de cromatina inmediato se examinó mediante ChIP de modificaciones de histonas junto con secuenciación de alto rendimiento (ChIP-Seq) en timocitos. 17 Primero examinamos el estado de metilación de H3K4 que se correlaciona con promotores y potenciadores transcripcionalmente equilibrados y transcripcionalmente activos. 23 H3K4me1 exhibió una amplia distribución en todo el Ikzf1 lugar. Por el contrario, H3K4me2 y H3K4me3 se enriquecieron específicamente en el Ikzf1 sitios reguladores putativos y no en todo el locus (J, p, D, E, F, G, H e I). No obstante, sus distribuciones diferían, siendo H3K4me3 muy enriquecido en los promotores y relativamente agotado en el 5 'y el DHS intrónico, mientras que H3K4me2 estaba distribuido uniformemente en todos estos sitios. Similar a H3K4me3, H3K9Ac mostró un fuerte enriquecimiento del promotor y un enriquecimiento menor en otros sitios reguladores. Similar a H3K4me2, las marcas potenciadoras p300 y H3K27Ac 20 mostraron una distribución no promotora.

Potenciadores transcripcionalmente activos en el Ikzf1 locus se evaluaron adicionalmente examinando la distribución de las formas de preiniciación y alargamiento de RNApII. 24 Las formas fosforiladas S5 y S2 de la ARN polimerasa, así como la marca de elongación transcripcional H3K36me3, se distribuyeron por todo el Ikzf1 locus (Figura 1). Por el contrario, la forma no fosforilada de la ARN polimerasa (reconocida por el anticuerpo 8WG16) que marca la fase de preiniciación de la transcripción y los potenciadores activos solo se detectó en la Ikzf1 agrupaciones reguladoras.

Así, la distribución diferencial de códigos de histonas, modificadores de cromatina y factores de transcripción en varios de los Ikzf1 Los grupos de DHS conservados respaldan su papel potencial como potenciadores de la transcripción en la regulación de la expresión de Ikaros durante el desarrollo.

Propiedades epigenéticas y transcripcionales del Ikzf1 potenciadores

El putativo Ikzf1 Los potenciadores se probaron para determinar su capacidad para promover la transcripción de un reportero de GFP de los principales Ikzf1 (B-p) promotor (Figuras 1 y 2A). Se generaron 16 casetes informadores en los que se conservó la orientación del potenciador putativo en relación con el promotor, como en el Ikzf1 lugar. Para cada casete informador, se generaron múltiples líneas transgénicas de ratón y se analizaron para determinar la expresión de GFP en leucocitos de sangre periférica (PBL). Se proporcionan el número de líneas para cada informador y el número de copia del transgén (Figuras complementarias 2 y 3, Tabla complementaria 1).

Actividades potenciadoras asociadas con la Ikzf1 sitios regulatorios. (A) Los diagramas de los constructos informadores utilizados en este estudio se muestran a la izquierda. El número de fundadores que expresan GFP se muestra sobre el número total de fundadores obtenidos para cada reportero. La significancia estadística de la diferencia (aumento) en las líneas fundadoras que expresan GFP en comparación con las líneas parentales B-pag-Las líneas de GFP se obtuvieron mediante análisis χ 2 y se muestran como PAG valor. (B) El porcentaje de GFP + PBL evaluados por citometría de flujo se representa para cada línea fundadora como círculos. Se calculó el porcentaje medio de GFP + PBL para cada informador transgénico para todos los fundadores que expresan GFP (barra negra) o para todos los fundadores (barra gris). (C) El MFI de GFP + PBL se estimó para cada línea fundadora (diamantes grises) de cada informador transgénico como se describe en el panel B.

Actividades potenciadoras asociadas con el Ikzf1 sitios regulatorios. (A) Los diagramas de los constructos informadores utilizados en este estudio se muestran a la izquierda. El número de fundadores que expresan GFP se muestra sobre el número total de fundadores obtenidos para cada reportero. La significancia estadística de la diferencia (aumento) en las líneas fundadoras que expresan GFP en comparación con las líneas parentales B-pag-Las líneas de GFP se obtuvieron mediante análisis χ 2 y se muestran como PAG valor. (B) El porcentaje de GFP + PBL evaluados por citometría de flujo se representa para cada línea fundadora como círculos. Se calculó el porcentaje medio de GFP + PBL para cada informador transgénico para todos los fundadores que expresan GFP (barra negra) o para todos los fundadores (barra gris). (C) El MFI de GFP + PBL se estimó para cada línea fundadora (diamantes grises) de cada informador transgénico como se describe en el panel B.

La actividad del Ikzf1 Se evaluaron las regiones reguladoras para contrarrestar el silenciamiento de la cromatina local y para promover la transcripción estimando el número de líneas transgénicas que expresan GFP (expresión & gt1% en PBL), la expresión en subconjuntos de PBL y el nivel medio de expresión del informador. La mayoría de las líneas transgénicas generadas por estos reporteros impulsados ​​por potenciadores exhibieron expresión de GFP en PBL (Figura 2A-B). Este fue un aumento significativo (PAG & lt .05) sobre la pequeña fracción de fundadores que expresan GFP obtenida con el reportero parental impulsado por promotor solo (Figura 2A B-pag-GFP, 11%). 16 Entre los Ikzf1 Las regiones reguladoras, J, D y E mostraron la actividad potenciadora más fuerte, apoyando la expresión en 88% a 93% de las líneas transgénicas, mientras que F, I y H eran más débiles, apoyando la expresión en 53% a 75% de las líneas transgénicas (Figura 2A suplementaria Figuras 2 y 3 suplementaria Tabla 1).

La expresión del informador en los PBL fue muy variada (Figura 2B), lo que indica que aunque la Ikzf1 Los potenciadores inicialmente podían contrarrestar la cromatina en el sitio de integración del informador, no pudieron mantener la cromatina transcripcionalmente permisiva dentro de la Ikzf1-expresando subconjuntos de PBL. Por ejemplo, aunque el B-pag-El reportero GFP-D se expresó en el 93% de sus líneas transgénicas (PAG & lt 5 × 10 7), en promedio, se detectó expresión en solo el 42% de los PBL. Por otro lado, aunque el B-pagEl indicador -GFP-H se expresó en una fracción más pequeña (53%) de las líneas fundadoras, la expresión se observó en una fracción más grande (48%) de PBL, lo que indica un mayor potencial para mantener la cromatina transcripcionalmente permisiva (Figura 2B).

los Ikzf1 los potenciadores se evaluaron adicionalmente midiendo el nivel de expresión del informador. En particular, la intensidad de fluorescencia media (MFI) de las células que expresan GFP de las líneas D enhancer-reporter superó a las de todos los demás indicadores, ya sea que se midan a partir de todas las líneas transgénicas o de las líneas transgénicas que expresan (Figura 2C, el promedio se muestra como una línea gris o negra , respectivamente). La considerable diferencia en la expresión proporcionada por el MFI promedio de todas las líneas transgénicas frente a las que expresan las líneas transgénicas para F, H y yo sugirió que estos potenciadores eran potentes para estimular la transcripción pero solo en la cromatina permisiva. Por el contrario, aunque el potenciador de J cadena arriba fue débil para estimular la transcripción, fue muy eficaz para contrarrestar la cromatina represiva, proporcionando un mayor número de líneas transgénicas de baja expresión.

Así, el análisis de los reporteros transgénicos reveló la presencia de 2 tipos de cis-Elementos activos asociados con Ikzf1 potenciadores (Tabla complementaria 1). Un tipo contrarrestó la cromatina restrictiva y la variegación del efecto de posición (PEV) como se documenta por un aumento tanto en el número de fundadores expresivos como en los PBL que expresan reporteros. Estos elementos probablemente apoyan el reclutamiento de factores epigenéticos que promueven un estado de cromatina transcripcionalmente permisivo. El segundo tipo fue potente para estimular la transcripción en cromatina permisiva, en línea con la actividad de un potenciador clásico que funciona promoviendo la fase de iniciación o elongación del ciclo de RNApII.

Especificidad del tipo celular del Ikzf1 potenciadores

los Ikzf1 A continuación, se evaluaron los potenciadores por sus efectos específicos del tipo de célula sobre la expresión del informador (Figuras 2, 3 y 5 complementarias de la Figura 3A-B). El patrón de expresión de sus líneas transgénicas se examinó en busca de desviaciones del perfil de "alto B / bajo T / mieloide intermedio" proporcionado por el reportero impulsado por el promotor justo parental en el que se probaron estos potenciadores (Figura 3A-B B-pag-GFP). Se examinaron 16 PBL de cada línea fundadora para determinar la expresión de GFP en células B (B220 +), células T (TCRβ +) y células mieloides (Mac-1 +) en sangre periférica mediante citometría de flujo (Figura 3A, figuras complementarias 2, 3, y 5).

Especificidad del tipo celular del Ikzf1 potenciadores. (A) Los diagramas de los constructos informadores utilizados en este estudio se muestran a la izquierda. Los patrones de expresión de GFP específicos de linaje en células PB - B (B220 +, B), células T (TCRβ +, T) y células mieloides (Mac-1 +, My) se resumen a la derecha. (B) Ikzf1 actividad potenciadora en las células T. Las barras de error (desviación estándar) indican la variación de la expresión de GFP entre las diferentes líneas fundadoras generadas por cada informador basado en potenciador. Student t prueba *PAG & lt 5 × 10 −3. (C) Actividad del potenciador D y H en la LSK enriquecida con HSC / MPP (Lin - c-Kit + Sca-1 +), según lo determinado por la expresión de B-pag-GFP-D y -H reporteros comparados con el parental B-pag-Reportera de GFP. El LMPP se define como LSK Flt3 + (puerta cuadrada). La expresión de GFP en LSK se muestra como un histograma o junto con la expresión de Flt3 como un gráfico de contorno. El histograma de línea gris fina representa un control negativo del reportero.

Especificidad del tipo celular del Ikzf1 potenciadores. (A) Los diagramas de los constructos informadores utilizados en este estudio se muestran a la izquierda. Los patrones de expresión de GFP específicos de linaje en células PB - B (B220 +, B), células T (TCRβ +, T) y células mieloides (Mac-1 +, My) se resumen a la derecha. (B) Ikzf1 actividad potenciadora en las células T. Las barras de error (desviación estándar) indican la variación de la expresión de GFP entre las diferentes líneas fundadoras generadas por cada informador basado en potenciador. Student t prueba *PAG & lt 5 × 10 −3. (C) Actividad del potenciador D y H en la LSK enriquecida con HSC / MPP (Lin - c-Kit + Sca-1 +), según lo determinado por la expresión de B-pag-GFP-D y -H reporteros comparados con el parental B-pag-Reportera de GFP. El LMPP se define como LSK Flt3 + (puerta cuadrada). La expresión de GFP en LSK se muestra como un histograma o junto con la expresión de Flt3 como un gráfico de contorno. El histograma de línea gris fina representa un control negativo del reportero.

La mayoría de las líneas fundadoras generadas por los cassettes informadores J, E, F, G e I mostraron un patrón de expresión similar al cassette parental (Figura 3A-B suplementaria, Figuras 2 y 5, Tabla 1 suplementaria). En agudo contraste, un número significativamente grande de las líneas fundadoras D y H expresaron GFP en una fracción importante de células T en comparación con el reportero parental (34% y 43% en comparación con 4% Figura 3A-B complementaria Figuras 2 y 3 Tabla complementaria 1). La proporción media de células mieloides GFP + también fue más alta en las líneas transgénicas D (37% frente a 22% suplementarias de las Figuras 2 y 3 de la Tabla 1 suplementaria). De todos los Ikzf1 potenciadores probados aquí, D fue el único capaz de estimular la expresión del informador en el LMPP, el primer paso en la restricción del linaje linfoide, por encima de los niveles basales detectados en la población enriquecida con HSC (Figura 3C, LSK Flt3 + vs LSK Flt3 -). 4

Por lo tanto, mientras que los 6 Ikzf1 los potenciadores (J, D, E, F, H e I) estaban activos en las células B y mieloides, 2 (D y H) también estaban activos en las células T y probablemente eran responsables de la alta expresión de Ikzf1 en timocitos necesarios para la maduración y homeostasis normales. 1,9,17,25,26 Uno de los 2 Ikzf1 Los potenciadores específicos de células T (D) estaban activos en el LMPP y se asociaron tanto con un aumento en la expresión de Ikaros como con la inducción del potencial de diferenciación del linaje linfoide. 4,6

El potenciador D juega un papel no redundante en la regulación transcripcional de Ikzf1

Dada la importancia potencial del potenciador D, examinamos cómo su eliminación afectaba la actividad transcripcional en el Ikzf1 lugar. Un Ikzf1 El clon BAC con el reportero de CD2 humano (hCD2) insertado en el exón 2 (Ik-BAC-hCD2) fue diseñado para contener loxP sitios de reconocimiento que flanquean la región D de 1,7 kb y se probó la expresión en células linfoides y mieloides antes de (Ik-BAC-lDl) y después de la deleción mediada por Cre (Ik-BAC-ΔD) (Figura 4A). Debido a que estos vectores BAC se inyectaron en huevos fertilizados en forma circular, supusimos que las líneas transgénicas con ≥3 copias del transgén tenían ≥1 clon BAC intacto. Todos los fundadores obtenidos con Ik-BAC-hCD2 e Ik-BAC-lD1 se expresaron en aproximadamente el 90% de las células T, B y mieloides, incluso cuando estaban presentes 2 copias del transgén BAC (Figura 4B). Por el contrario, en todos los fundadores obtenidos con Ik-BAC-ΔD, se detectó una expresión muy variada del indicador de hCD2 en todos los tipos de células, independientemente del número de copias del transgén (Figura 4C). Por lo tanto, el potenciador D es crítico para contrarrestar los efectos represivos de la cromatina en el Ikzf1 locus y mantener la transcripción en niveles altos, una actividad que no puede ser sustituida por la otra Ikzf1 potenciadores.

El potenciador D es necesario para la transcripción normal en el Locus Ikzf1 (A) Diagrama del Ikzf1 Construcciones informadoras transgénicas BAC. El primer exón traducido (exón 2) en el Ikzf1 El clon BAC fue reemplazado por el CD2 humano (hCD2) gen indicador (rectángulo blanco) insertado en el codón de iniciación (Ik-BAC-CD2). Dos flanqueando loxP Se insertaron sitios (triángulos blancos) en 5 'y 3' de la región D (Ik-BAC-lDl). La región D fue eliminada de Ik-BAC-lDl por Cre recombinasa para generar la construcción Ik-BAC-ΔD. (B) Expresión del indicador en el PBL de las líneas transgénicas Ik-BAC con la región D del potenciador intacta. (C) Expresión del indicador en PBL de líneas transgénicas Ik-BAC-ΔD. El número de copia se anota además de cada fundador generado a partir de la línea Ik-BAC-CD2 o Ik-BAC-DL. El porcentaje de células mieloides hCD2 + (barras grises), células T (barras negras) y células B (barras blancas) se determinó para cada animal fundador mediante citometría de flujo con anticuerpos para Mac-1, B220 y TCRβ, respectivamente. N.D., no determinado.

El potenciador D es necesario para la transcripción normal en el Locus Ikzf1 (A) Diagrama del Ikzf1 Construcciones informadoras transgénicas BAC. El primer exón traducido (exón 2) en el Ikzf1 El clon BAC fue reemplazado por el CD2 humano (hCD2) gen indicador (rectángulo blanco) insertado en el codón de iniciación (Ik-BAC-CD2). Dos flanqueando loxP Se insertaron sitios (triángulos blancos) en 5 'y 3' de la región D (Ik-BAC-lDl). La región D fue eliminada de Ik-BAC-lDl por Cre recombinasa para generar la construcción Ik-BAC-ΔD. (B) Expresión del indicador en el PBL de las líneas transgénicas Ik-BAC con la región D del potenciador intacta. (C) Expresión del indicador en PBL de líneas transgénicas Ik-BAC-ΔD. El número de copia se anota además de cada fundador generado a partir de la línea Ik-BAC-CD2 o Ik-BAC-DL. El porcentaje de células mieloides hCD2 + (barras grises), células T (barras negras) y células B (barras blancas) se determinó para cada animal fundador mediante citometría de flujo con anticuerpos para Mac-1, B220 y TCRβ, respectivamente. N.D., no determinado.

Caracterización de la cis-Elementos actuantes del Ikzf1 potenciador D

Además caracterizamos el cis-Elementos actuantes responsables de las actividades del potenciador D. La región de 1,7 kb que abarca este potenciador contenía 7 áreas más pequeñas (D1-D7) de fuerte conservación ratón-humano (86% -96%) que variaban en tamaño de 37 a 103 pb (Figura 5A suplementaria Figura 6 suplementaria Tabla 3). Las primeras 4 áreas (D1-D4) se agruparon en el extremo 5 ′ y se asociaron con los 2 sitios DHS-C6 (Figura 5A DHS-C6-a y DHS-C6-b), mientras que los otros 3 sitios (D5- D7) cubrió un total de 394 bases ubicadas en el extremo 3 ′ (Figura 5A). Dos fragmentos de 500 pb que abarcan las secuencias D1 a D4 (DI) y D5 a D7 (DIII), respectivamente, se clonaron en la B-pag-Cassette de GFP y se evaluó la actividad en comparación con los 2 vectores parentales (Figura 5B B-pag-GFP y B-pag-GFP-D).

Específico de células T cis-Elementos que actúan en el potenciador D. (A) Las áreas de conservación de la secuencia (D1-D7) dentro del potenciador D de 1.7 kb se muestran como rectángulos. Las líneas horizontales debajo de la región D representan las dos subregiones DI y DIII de 500 pb utilizadas en los indicadores transgénicos. (B) Comparación de la expresión del informador entre el B-pag-GFP-DI, B-pag-GFP-DIII, B-pag-GFP y B-pag-Líneas fundadoras de GFP-D. Las construcciones informadoras utilizadas para generar estas líneas fundadoras se muestran a la izquierda. El número de fundadores que expresan GFP se muestra sobre el número total de fundadores generados. La significancia estadística de la diferencia (aumento o disminución) en la proporción de fundador que expresa GFP en comparación con el B- parentalpag-Línea GFP (a) o B-pag-GFP-D (b) fue proporcionado por análisis χ 2 y se muestra como un PAG valor. El porcentaje de PBL positivos para GFP se representa para cada línea fundadora (círculo). Se calculó el porcentaje medio de GFP + PBL para cada informador transgénico para todos los fundadores que expresan GFP (barra negra) o para todos los fundadores (barra gris). La especificidad del tipo de célula de cada informador se muestra a la derecha. (C) El MFI de GFP + PBL de B-pag-GFP-D, B-pag-GFP-D-I y B-pagSe calcularon las líneas transgénicas -GFP-D-III para cada fundador (diamantes grises). Las líneas grises indican la IMF promedio entre todos los fundadores, y las líneas negras indican la IMF promedio entre los fundadores que expresan GFP. (D) Expresión de GFP específica de linaje en los PBL de B-pag-GFP-D, B-pag-GFP-DI y B-pag-Fundadores de GFP-DIII. Se muestra el porcentaje promedio de células GFP + dentro de las células B de sangre periférica (B), células T (T) y células mieloides (My). La importancia de la diferencia de expresión entre los reporteros de GFP fue evaluada por Student t prueba *PAG & lt 5 × 10 −2 **PAG & lt 5 × 10 −3. Las barras de error (desviación estándar) indican la variación de la expresión de GFP entre las diferentes líneas fundadoras realizadas por cada informador basado en potenciador.

Específico de células T cis-Elementos que actúan en el potenciador D. (A) Las áreas de conservación de la secuencia (D1-D7) dentro del potenciador D de 1.7 kb se muestran como rectángulos. Las líneas horizontales debajo de la región D representan las dos subregiones DI y DIII de 500 pb utilizadas en los indicadores transgénicos. (B) Comparación de la expresión del informador entre el B-pag-GFP-DI, B-pag-GFP-DIII, B-pag-GFP y B-pag-Líneas fundadoras de GFP-D. Las construcciones informadoras utilizadas para generar estas líneas fundadoras se muestran a la izquierda. El número de fundadores que expresan GFP se muestra sobre el número total de fundadores generados. La significancia estadística de la diferencia (aumento o disminución) en la proporción de fundador que expresa GFP en comparación con el B- parentalpag-Línea GFP (a) o B-pag-GFP-D (b) fue proporcionado por análisis χ 2 y se muestra como un PAG valor. El porcentaje de PBL positivos para GFP se representa para cada línea fundadora (círculo). Se calculó el porcentaje medio de GFP + PBL para cada informador transgénico para todos los fundadores que expresan GFP (barra negra) o para todos los fundadores (barra gris). La especificidad del tipo de célula de cada informador se muestra a la derecha. (C) El MFI de GFP + PBL de B-pag-GFP-D, B-pag-GFP-D-I y B-pagSe calcularon las líneas transgénicas -GFP-D-III para cada fundador (diamantes grises). Las líneas grises indican la IMF promedio entre todos los fundadores, y las líneas negras indican la IMF promedio entre los fundadores que expresan GFP. (D) Expresión de GFP específica de linaje en los PBL de B-pag-GFP-D, B-pag-GFP-DI y B-pag-Fundadores de GFP-DIII. Se muestra el porcentaje promedio de células GFP + dentro de las células B de sangre periférica (B), células T (T) y células mieloides (My). La importancia de la diferencia de expresión entre los reporteros de GFP fue evaluada por Student t prueba *PAG & lt 5 × 10 −2 **PAG & lt 5 × 10 −3. Las barras de error (desviación estándar) indican la variación de la expresión de GFP entre las diferentes líneas fundadoras realizadas por cada informador basado en potenciador.

Ambos subdominios potenciadores generaron un gran número de líneas fundadoras de expresión que eran comparables a las del potenciador D intacto (Figura 5B). Sin embargo, dentro de las poblaciones de expresión, la variedad del indicador fue mayor en comparación con la del potenciador intacto. En promedio, el 42% de los PBL de las líneas fundadoras D expresaron GFP, pero solo el 27% o el 15% de los PBL de los fundadores DI o DIII expresaron GFP, respectivamente (Cuadro 2 complementario de la Figura 5B).

El nivel de expresión del informador apoyado por los 2 subdominios del potenciador D difería mucho, siendo los de DIII mucho más bajos en comparación con DI o con el potenciador parental intacto (Figura 5C-D MFI: 512 frente a 1282 o 512 frente a 1567). La expresión soportada por DI fue comparable a la del potenciador intacto (Figura 5C MFI: 1282 vs 1567). Además, DI pero no DIII fue capaz de conferir expresión en una fracción sustancial de células T (Figura 5B, Figura 4 complementaria D, Tabla 2 complementaria). Según estos criterios, la subregión DI tenía propiedades transcripcionales y específicas del tipo de célula similares a las del potenciador de longitud completa D.

Combinación de Ikzf1 los potenciadores funcionan como una región de control de locus

Cuando se prueba individualmente, el Ikzf1 los potenciadores fueron capaces de un alivio apreciable pero no completo de PEV en la expresión del informador (Figura 2). Esto sugiere que las actividades potenciadoras combinadas, como se encuentran en el Ikzf1 locus, son necesarios para la expresión adecuada de Ikaros en células linfo-mieloides.

Para probar esta hipótesis, generamos un reportero transgénico que combinó la mayoría de estos elementos, preservando su orientación como en el locus endógeno (locus mini-regulador Ikaros [Ik-MC2] Figura 6A). Ocho de los 11 fundadores transgénicos positivos exhibieron expresión informadora de GFP en casi el 100% de las células B, células T y células mieloides en PBL (Figura 6B). Los 3 fundadores con baja expresión de informador pueden deberse a la integración de un informador transgénico incompleto en el genoma. Por tanto, la actividad combinada de los elementos reguladores presentes en el casete Ik-MC2 puede contrarrestar el PEV y proporcionar un patrón de expresión endógeno similar a Ikaros en los PBL (Figura 6B).

Actividad combinada de Ikzf1 elementos reguladores en células linfo-mieloides y neuronales. (A) Diagrama de la construcción Ik-MC2. (B) Expresión informadora de GFP en subconjuntos de PBL de las líneas fundadoras Ik-MC2. El porcentaje de células mieloides GFP + (barras grises), células T (barras negras) y células B (barras blancas) se determinó para cada línea fundadora mediante un análisis de clasificador de células activado por fluorescencia (FACS). (C) Expresión de GFP en las poblaciones progenitoras de la médula ósea enriquecidas con HSC (LSK) y eritro-mieloide (LK-Lin - c-Kit + Sca-1 -). Se muestra la expresión de CD34 y Flt3 en los subconjuntos alto (hi) y bajo (lo) de LSK y LK GFP. El histograma de línea fina representa la tinción FACS de un indicador o control negativo de marcador. (D) Vista lateral de la expresión de GFP en el cerebro P0 en todo el montaje. El contorno del cerebro se muestra como una línea blanca. Se observa expresión brillante de GFP en los ganglios basales. No se observó fluorescencia en los controles de tipo salvaje en estas condiciones. Los corchetes marcan el plano aproximado de la sección frontal que se muestra en el panel E. (E) Vista esquemática de la sección que indica la corteza (COR), el putamen caudado (CP) y el tabique (S) y el área que se muestra en la fotografía (recuadro) . La expresión de GFP se observa en el putamen caudado. Con la excepción de las células dispersas en otros lugares, no se observa GFP en el tejido circundante.

Actividad combinada de Ikzf1 elementos reguladores en células linfo-mieloides y neuronales. (A) Diagrama de la construcción Ik-MC2. (B) Expresión informadora de GFP en subconjuntos de PBL de las líneas fundadoras Ik-MC2. El porcentaje de células mieloides GFP + (barras grises), células T (barras negras) y células B (barras blancas) se determinó para cada línea fundadora mediante un análisis de clasificador de células activado por fluorescencia (FACS). (C) Expresión de GFP en las poblaciones progenitoras de la médula ósea enriquecidas con HSC (LSK) y eritro-mieloides (LK-Lin - c-Kit + Sca-1 -). Se muestra la expresión de CD34 y Flt3 en los subconjuntos alto (hi) y bajo (lo) de LSK y LK GFP. El histograma de línea fina representa la tinción FACS de un indicador o control negativo de marcador. (D) Vista lateral de la expresión de GFP en el cerebro P0 en todo el montaje. El contorno del cerebro se muestra como una línea blanca. Se observa expresión brillante de GFP en los ganglios basales. No se observó fluorescencia en los controles de tipo salvaje en estas condiciones. Los corchetes marcan el plano aproximado de la sección frontal que se muestra en el panel E. (E) Vista esquemática de la sección que indica la corteza (COR), el putamen caudado (CP) y el tabique (S) y el área que se muestra en la fotografía (recuadro) . La expresión de GFP se observa en el putamen caudado. Con la excepción de las células dispersas en otros lugares, no se observa GFP en el tejido circundante.

También evaluamos el perfil de expresión del casete Ik-MC2 en las HSC y en los progenitores restringidos de linaje temprano. Esto fue muy similar a lo descrito previamente para los reporteros que contienen potenciador D (Figura 3C B-pag-GFP-D y B-pag-GFP-C). 4 La expresión bimodal del reportero GFP soportado por el casete Ik-MC2 separó el LMPP del HSC multipotente (Figura 6C LSK Flt3 ++: GFP hi de LSK Flt3 neg – lo: GFP lo). También segregó progenitores de granulocitos-macrófagos de progenitores de megacariocitos-eritrocitos en una población progenitora mixta de eritro-mieloides (Figura 6C LK CD34 +: GFP hi de LK CD34 neg-lo: GFP +). 4

Ikzf1 también se expresa en el cuerpo estriado en desarrollo, 27,28 donde puede desempeñar un papel en la función del progenitor neural. 29,30 En contraste con el potenciador D u otro Ikzf1 potenciadores probados de forma aislada, su actividad combinada apoyó la expresión de GFP en el cuerpo estriado (Figura 6D-E). Las secciones a través de esta región del cerebro revelaron una expresión en todo el putamen caudado similar a la exhibida por el endógeno. Ikzf1 locus (Figura 6D-E).

Por lo tanto, la combinación de 9 de 10 de los Ikzf1 Las regiones conservadas (J, B, p, D, E, F, G, H e I) en un locus miniregulador aseguraron la expresión génica en las células del linaje linfo-mieloide y neuronal de una manera que se asemejaba a la especificidad del tipo celular del endógeno Ikzf1 locus y que no se vio afectado por los efectos de silenciamiento de la cromatina local.

Red de factores de transcripción que regulan Ikzf1 expresión

Para obtener información sobre los factores de transcripción involucrados en Ikzf1 regulación, se realizó la búsqueda de motivos para los sitios de unión del factor de transcripción en los potenciadores D y H. El potenciador D se enriqueció específicamente con sitios de unión para factores de transcripción expresados ​​en progenitores hematopoyéticos tempranos como Runx (Ejecutarx1-3), Homeobox A9 (Hoxa9), proteína de unión a secuencia especial rica en AT 1 (Satb1), factores reguladores de interferón (Irf1, Irf4), Proteínas de unión a CCAAT / potenciador (Cebpa, Cepbb) y factor potenciador de miocitos 2C (Mef2c) (Cuadro suplementario 7D-H de la Figura 7B). Estos primeros sitios de unión al factor de transcripción linfo-mieloide no estaban presentes en el potenciador H. No obstante, varios sitios de unión al factor compartidos para los factores de transcripción con actividad previamente informada en las células T estaban presentes en los potenciadores D y H, como E2A (Tcf3), Ets-1 (Ets1), Tal-1 (Tal1) e Ikaros (Ikzf1) (Tabla complementaria 7D, H Figura 7B). La disección adicional de D en las subregiones DI y DIII proporcionó evidencia independiente de que las actividades específicas de células T y progenitoras del potenciador D residían dentro de la subregión DI (Tabla complementaria 7DI-DIII Figura 7B).

Red de factores de transcripción dirigidos Ikzf1 potenciadores. (A) El enriquecimiento de TF alcanza su punto máximo Ikzf1 el locus en timocitos (células T), CH12 (células B) y precursores eritoides se visualizaron mediante el navegador IGV. Se proporciona un resumen de las actividades reguladoras sobre las respectivas regiones potenciadoras en el Ikzf1 lugar. (B-C) Un modelo de Ikzf1 regulación. (B) Ikzf1 interacciones potenciador-promotor durante la hematopoyesis. Los factores específicos de eritroides que se unen al potenciador G permiten interacciones con el promotor A específico de mieloides y la expresión de Ikaros durante la eritropoyesis temprana. Los factores linfo-mieloides específicos que se unen a los potenciadores D y H apoyan las interacciones con el promotor linfo-mieloide específico B y la expresión de Ikaros durante la diferenciación linfoide y mieloide. Los factores de transcripción específicos de linaje en estos sitios se representan como círculos codificados por colores. Las flechas indican interacciones potenciales entre potenciadores específicos del tipo de célula y promotores que apoyan Ikzf1 expresión en las etapas de desarrollo apropiadas. (C) Ikzf1 actividad de la región reguladora durante la linfopoyesis. los Ikzf1 El promotor linfo-mieloide B, aunque activo desde las HSC a través de la diferenciación de células B y mieloide, requiere la entrada de un potenciador para superar los efectos restrictivos de la cromatina y el PEV (círculo amarillo). Los potenciadores J, D (C), E, ​​F, H e I contrarrestan el PEV y aumentan Ikzf1 expresión genética (círculo naranja). Para Ikzf1 expresión más allá de la etapa DN del desarrollo de células T, se requiere información de los potenciadores D (C) (azul) y H (verde). Inducción de Ikzf1 la expresión en el LMPP al nivel requerido para la diferenciación de linfocitos depende de la actividad del potenciador D (C) (azul).

Red de factores de transcripción dirigidos Ikzf1 potenciadores. (A) El enriquecimiento de TF alcanza su punto máximo Ikzf1 el locus en timocitos (células T), CH12 (células B) y precursores eritoides se visualizaron mediante el navegador IGV. Se proporciona un resumen de las actividades reguladoras sobre las respectivas regiones potenciadoras en el Ikzf1 lugar. (B-C) Un modelo de Ikzf1 regulación. (B) Ikzf1 interacciones potenciador-promotor durante la hematopoyesis. Los factores específicos de eritroides que se unen al potenciador G permiten interacciones con el promotor A específico de mieloides y la expresión de Ikaros durante la eritropoyesis temprana. Los factores linfo-mieloides específicos que se unen a los potenciadores D y H apoyan las interacciones con el promotor linfo-mieloide específico B y la expresión de Ikaros durante la diferenciación linfoide y mieloide. Los factores de transcripción específicos del linaje en estos sitios se representan como círculos codificados por colores. Las flechas indican interacciones potenciales entre potenciadores específicos del tipo de célula y promotores que apoyan Ikzf1 expresión en las etapas de desarrollo apropiadas. (C) Ikzf1 actividad de la región reguladora durante la linfopoyesis. los Ikzf1 El promotor linfo-mieloide B, aunque activo desde las HSC a través de la diferenciación de células B y mieloide, requiere la entrada de un potenciador para superar los efectos restrictivos de la cromatina y el PEV (círculo amarillo). Los potenciadores J, D (C), E, ​​F, H e I contrarrestan el PEV y aumentan Ikzf1 expresión genética (círculo naranja). Para Ikzf1 expresión más allá de la etapa DN del desarrollo de células T, se requiere información de los potenciadores D (C) (azul) y H (verde). Inducción de Ikzf1 La expresión en el LMPP al nivel requerido para la diferenciación de linfocitos depende de la actividad del potenciador D (C) (azul).

Factores de transcripción con supuestos sitios de unión en el Ikzf1 Los elementos regulatorios fueron evaluados más a fondo mediante el análisis de los datos de ChIP-seq en el Ikzf1 locus 17,19,31 (Figura 7A). Muchos de los factores pioneros del linaje linfoide, como Ikaros, HEB, Runx1 y TCF-1, se unieron en múltiples sitios en el Ikzf1 lugar. El potenciador D apoyó un fuerte enriquecimiento de una multitud de factores de transcripción expresados ​​desde las primeras hasta las últimas etapas de la diferenciación linfoide (E-box / HEB, Runx1, TCF-1, Ets-1, c-Myc), de acuerdo con la amplia actividad del potenciador desde los primeros progenitores hasta las etapas posteriores en la diferenciación de linfocitos y su papel clave en la Ikzf1 regulación. Curiosamente, el potenciador vecino E mostró un enriquecimiento de factores de transcripción similar al D, aunque su actividad in vivo fue más restringida. El potenciador de H con actividad solo en las células T tenía un repertorio limitado de factores de transcripción que incluían Ikaros, TCF-1, Ets-1 y c-Myc. Finalmente, todos los factores de transcripción promotores linfoides se unieron al promotor linfo-mieloide B, mientras que la unión del factor de transcripción específico de eritroides GATA-1 se detectó en las proximidades del promotor A específico de mieloides, que estaba específicamente marcado por H3K4me3 y H3K9Ac en progenitores eritroides. Análisis del factor de transcripción eritroide como GATA-1, GATA-2 y SCL / Tal-1 (Tal1) identificaron el enriquecimiento en las regiones F y G en la vecindad de H3K9Ac, lo que sugiere que estos pueden ser potenciadores responsables de apoyar la expresión de Ikaros en progenitores eritroides. (Figura 7A-B).


INTRODUCCIÓN

La propensión inherente de las guaninas a autoasociarse formando estructuras helicoidales de cuatro hebras se conoce desde principios de la década de 1960 (1). Posteriormente se demostró que la secuencia de ADN conservada se repite de los telómeros forman estructuras G-quadruplex (o G4) in vitro (2, 3). Desde entonces, numerosos análisis bioquímicos y estructurales han establecido que las secuencias de ácidos nucleicos, tanto de ADN como de ARN, que contienen corridas de guaninas (tractos G) separadas por otras bases se pliegan espontáneamente en estructuras G-cuádruplex. in vitro. Los componentes básicos de los G-cuádruplex son G-cuartetos que se forman a través de un arreglo cíclico de puentes de hidrógeno de Hoogsten de cuatro guaninas entre sí. Los cuartetos G planos se apilan uno encima del otro formando estructuras helicoidales de cuatro hilos. La formación de G-quadruplex es impulsada por cationes monovalentes como Na + y K + y, por lo tanto, las condiciones fisiológicas del tampón favorecen su formación (Figura 1A).

Estructura de G-quadruplex. Forma G-cuádruplex in vitro en secuencias de ADN o ARN que contienen tractos de tres a cuatro guanina. (A) Los componentes básicos de los G-cuádruplex son G-cuartetos que surgen de la asociación de cuatro guaninas en una disposición cíclica estabilizada por puentes de hidrógeno de Hoogsten (N1-N6 y N2-N7). Los cuartetos G planos se apilan uno encima del otro, formando estructuras helicoidales de cuatro hilos. La formación de G-quadruplex es impulsada por cationes monovalentes como Na + y K +. (B) Las estructuras G-cuádruplex son polimórficas y pueden subagruparse en diferentes familias, como por ejemplo paralelas o antiparalelas según la orientación de las hebras y pueden plegarse inter o intramolecularmente. El tipo de estructura depende del número de tractos G en una hebra.

Estructura de G-quadruplex. Forma G-cuádruplex in vitro en secuencias de ADN o ARN que contienen tractos de tres a cuatro guanina. (A) Los componentes básicos de los G-cuádruplex son G-cuartetos que surgen de la asociación de cuatro guaninas en una disposición cíclica estabilizada por puentes de hidrógeno de Hoogsten (N1-N6 y N2-N7). Los cuartetos G planos se apilan uno encima del otro, formando estructuras helicoidales de cuatro hilos. La formación de G-quadruplex es impulsada por cationes monovalentes como Na + y K +. (B) Las estructuras G-cuádruplex son polimórficas y pueden subagruparse en diferentes familias, como por ejemplo paralelas o antiparalelas según la orientación de las hebras y pueden plegarse inter o intramolecularmente. El tipo de estructura depende del número de tractos G en una hebra.

Las estructuras G-quadruplex son topológicamente muy polimórficas y pueden surgir del plegamiento intra o intermolecular de cadenas ricas en G. El plegamiento intramolecular requiere la presencia de cuatro o más tractos G en una hebra, mientras que el plegamiento intermolecular puede surgir de dos o cuatro hebras dando lugar a estructuras paralelas o antiparalelas dependiendo de la orientación de las hebras en un G-quadruplex ( 4, 5) (Figura 1B). El conocimiento de la estructura 3D precisa (6) es importante para el diseño de ligandos estabilizadores G-quadruplex utilizados para sondear las consecuencias de la estabilización G-quadruplex en procesos como la replicación del ADN y la transcripción de genes, y como fármacos anticancerígenos dirigidos a G-quadruplex en los promotores de oncogenes y en telómeros (7). La estabilidad térmica de los G-cuádruples depende de características tales como el número de G-cuartetos presentes en la estructura y la longitud y composición de los bucles formados por bases distintas de la guanina (8, 9). Sin embargo, la estabilidad térmica de un G-quadruplex in vitro puede no correlacionarse con su en vivo efecto (11). In vitro muchas estructuras de ADN G-quadruplex, una vez formadas, son termodinámicamente más estables que el ADN de doble hebra y, lo que es más importante para la función biológica, su cinética de despliegue es mucho más lenta que la de las estructuras de horquilla de ADN o ARN (10). En general, por lo tanto, es probable que las estructuras G-quadruplex obstruyan el metabolismo del ADN y el ARN y, por lo tanto, su formación debe regularse. En los últimos años, la evidencia cada vez más directa de la presencia de G-quadruplex en vivo, y la identificación de proteínas que regulan específicamente el plegamiento y despliegue de G-quadruplex han comenzado a proporcionar información sobre la aparición y función de G-quadruplex.

Posibles G-cuadruplex en el genoma humano

Análisis computacionales del genoma humano buscando con la secuencia de consenso (G3+norte1–7GRAMO3+norte1–7GRAMO3+norte1–7GRAMO3+) reveló que contiene más de 300 000 secuencias que tienen el potencial de formar G-cuadruplex (pG4 o PQS) (12). Es probable que esto sea una simplificación excesiva, ya que las secuencias no consensuadas pueden formar G-cuádruplex (13), así como una subestimación ya que faltan series largas de secuencias de ADN repetidas en la base de datos de secuencias disponible (S. Schuster, comunicación personal). Significativamente, se encontró que la localización de pG4s no es aleatoria: pG4 se colocaliza con regiones funcionales del genoma y, además, está altamente conservada entre diferentes especies (8), lo que indica una presión de selección para retener tales secuencias en sitios genómicos específicos. Esta conservación es más alta entre las especies de mamíferos y disminuye en las especies que no son de mamíferos y los organismos inferiores (14). Por último, las pG4 también están presentes en bacterias (15) y virus de ARN y ADN humanos (16-18).

La mayor abundancia de pG4 se encuentra en los telómeros, que en los seres humanos constan de 5 a 10000 pb de la repetición de TTAGGG dispuesta en tándem. También están altamente enriquecidos en promotores de genes, en el límite entre intrones y exones y la recombinación de cambio de clase de genes de inmunoglobulina diana (9). Lo más interesante es que recientemente ha surgido que el 90% de los orígenes de replicación del ADN humano contienen motivos pG4, y en densidades más altas cerca de los orígenes que se utilizan con frecuencia (19-21) (Figura 2A-C). El análisis de todo el genoma de los puntos de corte del ADN en diferentes tipos de cáncer muestra un enriquecimiento significativo en pG4 en la vecindad de las alteraciones del número de copias somáticas (22), así como los telómeros como objetivos favorecidos de la respuesta persistente al daño del ADN en el envejecimiento (23). También se ha encontrado que en aproximadamente 3000 genes humanos, pG4 están presentes en la región que especifica el 5'-UTR de los ARNm codificados y pueden reprimir la traducción (Figura 2D) (24, 25). Las largas transcripciones de ARN rico en G del ADN telomérico, TERRA, también son ricas en pG4 (26). Todas estas observaciones de la presencia conservada de pG4 en importantes regiones genómicas sugieren que proporcionan un papel regulador a través de su capacidad para formar estructuras G-quadruplex. Si todos o un subconjunto de pG4 presentes en los genomas tienen un en vivo Queda por establecer la función.

Posibles ubicaciones de estructuras G-quadruplex en células. Las búsquedas de todo el genoma han revelado la ubicación de regiones ricas en G con potencial de formación de G-quadruplex (pG4). Los pG4 se distribuyen de forma no aleatoria en el genoma y los promotores y los telómeros están particularmente enriquecidos en estas secuencias. En el núcleo, la formación de G-cuádruplex puede ocurrir en regiones ricas en G de doble hebra cuando el ADN se vuelve transitoriamente monocatenario, durante (A) transcripción y (C) replicación y (B) en los salientes ricos en G teloméricos monocatenarios. Fuera del núcleo, los G-quadruplex también pueden formarse en ARNm y (D) están involucrados en el control de la traducción. Las barras en T rojas indican impedimentos para la transcripción, replicación y traducción.

Posibles ubicaciones de estructuras G-quadruplex en células. Las búsquedas de todo el genoma han revelado la ubicación de regiones ricas en G con potencial de formación de G-quadruplex (pG4). Los pG4 se distribuyen de forma no aleatoria en el genoma y los promotores y los telómeros están particularmente enriquecidos en estas secuencias. En el núcleo, la formación de G-cuádruplex puede ocurrir en regiones ricas en G de doble hebra cuando el ADN se vuelve transitoriamente monocatenario, durante (A) transcripción y (C) replicación y (B) en los salientes ricos en G teloméricos monocatenarios. Fuera del núcleo, los G-quadruplex también pueden formarse en ARNm y (D) están involucrados en el control de la traducción. Las barras en T rojas indican impedimentos para la transcripción, replicación y traducción.

Para la biología, la pregunta importante es si, dónde y cuándo los pG4 mapeados forman estructuras G-quadruplex en vivo. El ADN genómico es principalmente de doble hebra y se estabiliza al empaquetarse en cromatina. Dos excepciones son las puntas mismas de los cromosomas eucariotas lineales que tienen la característica conservada de terminar en un saliente G monocatenario y en ARNm. En el ADN bicatenario, la oportunidad de formar G-cuádruplex surge durante la replicación, transcripción y reparación del ADN cuando el ADN se vuelve transitoriamente monocatenario mediante la ruptura del emparejamiento de bases de Watson-Crick, lo que permitiría el emparejamiento de bases de Hoogsteen alternativo presente en los G-cuádruples. tener lugar (27, 28) (Figura 2). De hecho, emergiendo en vivo Las observaciones son consistentes con la formación y resolución de G-quadruplex, lo que proporciona un papel regulador en estas vías (ver más abajo). Además, se puede prever que la formación de G-quadruplex podría verse favorecida por el estrés superhelical, el apiñamiento molecular (29) así como por proteínas de unión específicas de G-quadruplex (30). Además, contrariamente al dogma de emparejamiento de bases de Watson-Crick, se ha encontrado que los pares de bases de Hoogsteen se forman transitoriamente en el ADN bicatenario canónico (31), lo que sugiere que la formación de G-cuádruplex puede no requerir necesariamente la fusión previa de la doble hélice del ADN a través de , por ejemplo, la replicación del ADN.

Un gran avance en el establecimiento de la presencia y ubicación de G-quadruplexes en vivo surgió hace más de una década del desarrollo de anticuerpos específicos dirigidos contra los G-quadruplex de ADN telomrico. Esto permitió la primera visualización directa por en el lugar inmunotinción en los micronúcleos del cilio Stylonychia lemnae (32). Posteriormente, se utilizó un anticuerpo G-quadruplex para mapear la ubicación de tales estructuras en el ADN genómico humano mediante inmunoprecipitación seguida de una secuenciación profunda de los fragmentos de ADN seleccionados (33). Este estudio reveló su presencia en múltiples sitios genómicos: en los promotores de genes y en las regiones no traducidas (UTR) 5 ′ y 3 ′, lo que sugiere roles tanto en el inicio como en la terminación de la transcripción, dentro de los intrones y en las regiones subteloméricas. Cabe señalar que la inmunoprecipitación de las estructuras G-quadruplex se llevó a cabo con ADN aislado y fragmentado, por lo que no se puede excluir que la formación de G-quadruplex ocurriera durante el análisis. Otro enfoque para identificar G-quadruplex en todo el genoma fue mediante el uso de piridostatina, un fármaco que interactúa con G-quadruplex, que conduce a la replicación y al daño del ADN dependiente de la transcripción. La inmunoprecipitación de cromatina con un anticuerpo dirigido contra el marcador de daño del ADN histona gamma H2AX identificó genes enriquecidos en pG4s (34). Dado que estas observaciones son consistentes con la participación de G-quadruplex en varios procesos biológicos, la expectativa es que la formación de G-quadruplex sea dinámica y regulada y, por lo tanto, su distribución puede diferir en células diferenciadas de diversas formas. Por lo tanto, sería de considerable interés mapear la ocurrencia de G-quadruplex en células con diferentes repertorios transcripcionales.

Regulación de la formación de G-quadruplex

Una consideración esencial para la posible participación de G-quadruplex en biología es la cinética de formación (plegado) y resolución (despliegue). Como podría haberse anticipado, se está acumulando evidencia experimental del papel de las proteínas chaperonas y helicasas en la regulación del plegamiento y despliegue, respectivamente. La cinética de plegamiento de las secuencias que forman G-cuádruplex depende de la secuencia y varía de ms a minutos. Para secuencias que se pliegan muy rápido, como las repeticiones teloméricas humanas, la escala de tiempo de pliegue está en el rango de la replicación del ADN (35). Para otros, la cinética de la formación de G-quadruplex puede incrementarse drásticamente con las proteínas chaperonas (36). Gran parte de la evidencia disponible sobre el papel de los acompañantes proviene de in vitro estudios y la mayoría de las proteínas identificadas funcionan en los telómeros: el S. cerevisiae Hace dos décadas se demostró que la proteína de unión telomérica de doble hebra Rap1 promueve la formación de G-quadruplex (37): al igual que la subunidad reguladora de la telomerasa de levadura Est1 (38): y la proteína de unión telomérica humana TRF2 ha estado implicada tanto en el ADN como en el ARN (TERRA) Unión G-quadruplex (39). Convincente en vivo La evidencia ha comenzado a emerger: la in vitro La observación de que la proteína TEBPβ de unión al extremo de los telómeros ciliados mejora la formación de G-cuádruplex en 10 5 - 6 veces (36) ha sido confirmada por en vivo experimentos que demuestran que TEBPβ regula la formación de G-cuádruplex en los telómeros de una manera dependiente del ciclo celular (40). El factor de reconocimiento de la discordancia del ADN humano MutSα se une a los G-cuadruplex y promueve la sinapsis de las regiones de cambio de inmunoglobulina activadas transcripcionalmente (41). De particular interés, estudios recientes sugieren que la nucleofosmina (NPM1) interactúa con varias regiones G-cuádruplex en el ADN ribosómico, tanto in vitro y en vivo. NPM1 es una proteína nucleolar abundante implicada en la maduración y exportación de ribosomas y es el gen mutado con más frecuencia en la leucemia mieloide aguda (42). Significativamente nucleolina, (NCL) una fosfoproteína nucleolar esencial para la que existe in vitro evidencia de que se une al ADN G-cuadruplex con alta afinidad (43), se demostró muy recientemente que es secuestrado específicamente de una manera dependiente de la conformación por G-cuadruplex presentes en las transcripciones de ARN abortadas que surgen de la expansión de la repetición de hexanucleótidos (GGGGCC) n ( Figura 4B). Esto condujo a estrés nucleolar y perturbaciones en el procesamiento del ARN, iniciando una cascada molecular que resultó en un tipo de trastorno neurodegenerativo (44).

Actualmente se están acumulando pruebas que implican a helicasas especializadas en el desenrollamiento de ADN o ARN G-cuádruplex. Las helicasas son una gran familia de enzimas de desenrollado de ácidos nucleicos dependientes de ATP que tienen un papel importante en el mantenimiento del genoma. Es importante destacar que las mutaciones con pérdida de función en una familia distinta de helicasas de ADN vinculadas a varios cánceres y trastornos genéticos han proporcionado un vínculo directo entre las secuencias de pG4 y la inestabilidad del genoma. Está surgiendo que las helicasas G-cuádruplex desempeñan funciones importantes en la replicación del ADN y el mantenimiento de los telómeros (ver más abajo) (45). Las helicasas humanas WRN y BLM y S. cerevisiae Sgs1 están involucrados en el mantenimiento de los telómeros y tienen actividad de desenrollado G-cuádruplex in vitro y contienen un dominio RQC conservado que se une a G-quadruplex con alta afinidad (30). Las mutaciones en WRN causan el síndrome de Werner y las mutaciones en BLM el síndrome de Blooms, que dan lugar a un envejecimiento prematuro (progeria adulta) y un mayor riesgo de cáncer, respectivamente. La integridad del C. elegans El gen DOG-1 (deleción de ADN rico en guanina) es crucial para la estabilidad de los tractos G en el genoma (46). Además, la introducción de una secuencia de ADN que forma G-quadruplex in vitro fue altamente mutagénico y se eliminó de los genomas que carecen de DOG-1 (47). Estudios sobre la helicasa FANCJ de mamíferos, el ortólogo de la C. elegans Helicasa DOG-1, refuerzan estos hallazgos. La helicasa FANCJ está asociada con el trastorno hereditario de susceptibilidad al cáncer, anemia de Fanconi. Las líneas celulares de pacientes que carecen de FANCJ acumulan grandes deleciones de ADN genómico que se asignan a pG4s (48). La demostración de que FANCJ desenrolla preferentemente G-quadruplex sobre otros sustratos de ADN in vitro sugirió que la helicasa FANCJ, como DOG-1, funciona en la resolución de posibles impedimentos de replicación causados ​​por el ADN G-cuádruple (48). Las mutaciones en el regulador de la helicasa de ADN de mamíferos de la longitud de los telómeros RETL1 confieren una mayor susceptibilidad a ciertos tipos de cánceres (49). Debido a su similitud con la FANCJ humana y la C. elegans DOG-1 helicasas, y debido al aumento observado en la fragilidad de los telómeros por el tratamiento con el compuesto estabilizador G-quadruplex TMPyP4, RETL1 estuvo implicado en el desenrollamiento de G-quadruplex (50). Sin embargo, falta evidencia bioquímica directa de esta actividad. Los estudios sobre la familia de helicasa de ADN PIF1, que se conserva de las bacterias al hombre, proporcionan una fuerte evidencia de una potente actividad de desenrollado de G-quadruplex in vitro (51). Una inmunoprecipitación de cromatina en todo el genoma del S. cerevisiae Pif1 reveló pG4 en un subconjunto principal de sitios de unión de Pif1 y que dichos sitios en células deficientes en Pif1 son propensos a roturas de doble cadena de ADN (52–54). El PIF1 humano también parece actuar sobre pG4s (34). También está surgiendo que en ausencia de helicasas G-cuádruplex, varias nucleasas actúan para procesar las G-cuádruples que conducen a deleciones del tracto G. Se sabe que las nucleasas como la levadura Kem1 (55) y la FEN1, EXO1 y DNA2 humanas escinden los G-quadruplex in vitro (56). EXO1 y FEN1 juegan un papel en la replicación del ADN y están involucrados en el mantenimiento de los telómeros. El agotamiento de estas nucleasas causa disfunción de los telómeros (57, 58). Además, se ha demostrado que la proteína de replicación de unión de una sola hebra, RPA, que desempeña un papel importante en el mantenimiento de los telómeros, ayuda al despliegue de los G-quadruplex al cambiar el equilibrio de un estado plegado a uno desplegado (59).

Para los ARN G-cuádruplex, la evidencia convincente de su procesamiento en ARN monocatenario proviene de la identificación y caracterización de la ARN humana helicasa RHAU dependiente de ATP (60, 61). RHAU es una helicasa de caja DEAH que exhibe actividad de unión y resolución de ARN-G4 (y ADN-G4). El análisis de chip de inmunoprecipitación de ARN (RIP) identificó aproximadamente 100 ARN asociados con RHAU en vivo y la mayoría contenía secuencias de pG4s. Un objetivo es el ARN de telomerasa humana TER y la unión de RHAU depende de la presencia de una estructura G4 estable en la región 5 'de TER, tanto en vivo y in vitro (62). Las consecuencias funcionales de la caída de RHAU son la alteración del ensamblaje de la telomerasa y los cambios en la longitud de los telómeros (63). Estos datos proporcionan una fuerte evidencia de que existen proteínas que regulan directamente la resolución de G-cuadruplex, o la eliminación por completo, para evitar el estancamiento de la horquilla de replicación y la rotura del ADN y el plegamiento del ARN.

El papel positivo de las estructuras G-quadruplex de ADN y ARN en biología está menos documentado. Además de su papel en la especificación de los orígenes de replicación del ADN de los metazoos y en los telómeros (que se analiza más adelante), está surgiendo que los G-cuádruplex podrían explotarse como sitios de recombinación del ADN. Los estudios en una bacteria gramnegativa han demostrado que un G-quadruplex es necesario para que sirva como sitio de inicio de la recombinación. en vivo y es necesario para la variabilidad antigénica de la pilina (64, 65).

G-quadruplex en telómeros

La organización en tándem de las repeticiones de ADN telomérico ricas en G se conserva casi universalmente en eucariotas y tales secuencias son bien conocidas por formar G-cuadruplex in vitro. Directo en vivo La evidencia de la presencia de G-quadruplex en los telómeros se obtuvo por primera vez hace más de 10 años a partir de estudios que utilizaron anticuerpos muy específicos dirigidos contra G-quadruplex (32, 66). Estos estudios demostraron que se forma una estructura G-cuádruplex intermolecular antiparalela en los telómeros macronucleares de Estiloniquia, y lo que es más importante, la estructura G-quadruplex se resuelve durante la replicación del ADN, lo que sugiere que los G-quadruplex podrían actuar como una estructura de protección telomérica (Figura 3A y B). La observación de que el despliegue de G-cuádruplex está regulado por una fosforilación dependiente del ciclo celular de la proteína de unión al extremo del telómero TEBPβ y una helicasa similar a RecQ asociada a la telomerasa (64, 67, 68, 30), proporcionó una importante visión mecanicista de la realidad espacial y temporal. regulación del plegamiento y despliegue de G-quadruplex para permitir la síntesis de telómeros por la telomerasa cuando sea necesario.

G-cuadruplex en los telómeros. El saliente rico en G de los telómeros puede formar estructuras G-cuádruplex involucradas en la protección de los extremos de los telómeros y el metabolismo del ADN telomérico. (A) El largo saliente rico en G humano puede formar cadenas de G-cuádruplex plegadas intramolecularmente que pueden ofrecer protección final contra nucleasas o regular la actividad de la telomerasa. (B) Los telómeros ciliados forman estructuras G-cuádruplex intermoleculares que involucran dos telómeros promovidos por la proteína de unión al extremo del telómero TEBPβ. Los telómeros se unen a una estructura subnuclear (la matriz nuclear o andamio) mediante una interacción de la proteína de unión al extremo del telómero TEBPα. (C) La estabilización de G-quadruplex por ligandos de unión de G-quadruplex (estrellas amarillas) altera la síntesis de repetición de telómeros por la enzima telomerasa y conduce al acortamiento de los telómeros (modificado después de (80)).

G-cuadruplex en los telómeros. El saliente rico en G de los telómeros puede formar estructuras G-cuádruplex involucradas en la protección de los extremos de los telómeros y el metabolismo del ADN telomérico. (A) El largo saliente rico en G humano puede formar cadenas de G-cuádruplex plegadas intramolecularmente que pueden ofrecer protección final contra nucleasas o regular la actividad de la telomerasa. (B) Los telómeros ciliados forman estructuras G-cuádruplex intermoleculares que involucran dos telómeros promovidos por la proteína de unión al extremo del telómero TEBPβ. Los telómeros se unen a una estructura subnuclear (la matriz nuclear o andamio) mediante una interacción de la proteína de unión al extremo del telómero TEBPα. (C) La estabilización de G-quadruplex por ligandos de unión de G-quadruplex (estrellas amarillas) altera la síntesis de repetición de telómeros por la enzima telomerasa y conduce al acortamiento de los telómeros (modificado después de (80)).

En el caso de los telómeros humanos, la primera indicación de que los G-cuádruplex pueden estar presentes provino de la observación de que los ligandos estabilizadores del G-cuádruple alteran el metabolismo de los telómeros y provocan un acortamiento de los telómeros (figura 3C) (69-71). Este enfoque se basó en la observación de que los G-cuádruples teloméricos inhiben la actividad de la telomerasa (72). Actualmente se dispone de varios ligandos estabilizadores G-cuádruplex y se ha hecho evidente que muchos no se dirigen a la enzima telomerasa, sino al telómero mismo (73-75). Otros enfoques para identificar G-quadruplex en los telómeros humanos han incluido la unión de un ligando G-quadruplex radiomarcado a los cromosomas en metafase (76), el uso de un tinte de cianina fluorescente (77) y, más recientemente, el uso de una estructura de ingeniería. -anticuerpo específico contra G-cuádruplex humanos (78, 79). En todos los casos, las señales se detectaron en los extremos de los cromosomas, aunque no en todos los extremos. La resolución de la microscopía óptica no es lo suficientemente alta para descifrar si la unión se produjo en el extremo del cromosoma o en las regiones subteloméricas, también conocidas por adoptar estructuras G-cuádruplex. in vitro (80). Por estas razones, aún no se ha establecido si los G-cuádruples están presentes en los telómeros humanos. Sin embargo, el hallazgo de que varias helicasas que se sabe desenrollan G-quadruplex in vitro (como las helicasas WRN y BLM de RecQ), se localizan en los telómeros y son necesarios para la integridad de los telómeros en vivo, proporcionan una fuerte evidencia circunstancial de la existencia de tales estructuras en los telómeros de los mamíferos (81, 82, 30, 45, 83, 84).

La función principal de las helicasas WRN y BLM parece ser asegurar la replicación apropiada del ADN telomérico ayudando a los impedimentos G-quadruplex de desenrollado (Figura 5). La helicasa WRN es necesaria para prevenir la pérdida dramática de telómeros durante la replicación de la hebra rezagada de la hebra rica en G y la consecuente acumulación de aberraciones cromosómicas como las fusiones cromosómicas (85). WRN colocaliza e interactúa físicamente con las proteínas de unión a telómeros críticas TRF2 y POT1 (86) y tanto WRN como BLM se unen con alta afinidad a POT1 (87), lo que sugiere que las proteínas teloméricas de unión al ADN pueden funcionar en el reclutamiento de helicasa. Las células deficientes en RETL1 exhiben fragilidad de los telómeros (50, 81), que se ve reforzada por el agente estabilizador G-quadruplex TMPyP4. Esto nuevamente sugiere que los G-cuádruples se forman en los telómeros y, si no se resuelven, resultan en daños en el ADN. Sin embargo, el papel de RETL1 parece ser más general para ayudar a la replicación en todo el genoma, ya que interactúa directamente con la pinza de replicación PCNA (49).

G-quadruplex en transcripción y traducción

El hallazgo de que aproximadamente el 50% de los genes humanos contienen pG4 cerca de sus regiones promotoras sugirió un papel para los G-quadruplex en la regulación de la expresión génica (Figura 4A). Curiosamente, las pG4 son más frecuentes en los oncogenes o genes reguladores que en los genes domésticos o supresores de tumores (88, 89), (para revisión (9, 84)). La primera evidencia de que los pG4 en los promotores (Figura 4A) tienen un efecto sobre la expresión génica provino de estudios sobre el oncogén c-MYC, para los cuales se demostró que las mutaciones del pG4, o la adición de un ligando estabilizador G-cuádruplex afectaron la transcripción en vivo (90, 91). De manera más convincente, los estudios de expresión génica de todo el genoma en levaduras y células humanas muestran cambios en numerosos genes después de la adición del ligando de unión G-quadruplex TMPyP4 y, de manera significativa, los genes cuya expresión se vio afectada se enriquecieron en pG4 (Figura 4A) (92, 93) . Los estudios que utilizaron un anticuerpo monocatenario específico de G-quadruplex también mostraron alteraciones en la expresión génica de genes que contienen pG4 y el efecto no solo se limitó a los promotores, sino también a pG4 en los extremos de los genes, lo que sugiere una posible participación de G-quadruplex en ambos transcripcionales. iniciación y terminación (94, 95). Además, el análisis de todo el genoma de las células humanas ha revelado que los sitios de unión de las helicasas XPB y XPD asociadas a la transcripción se superponen significativamente con las pG4. Dado que estas helicasas se unen y despliegan G-quadruplex, es probable que se recluten en G-quadruplex en el genoma para ayudar a la transcripción (96).

G-quadruplex en transcripción y traducción. (A) Las secuencias de pG4 están presentes en aproximadamente el 50% de los promotores de genes humanos. La formación de G-quadruplex podría afectar el inicio de la transcripción por la ARN polimerasa, o si está presente en la hebra antisentido inhibir la transcripción. (B) La presencia de G-cuádruplex formados en la UTR 5 'de los ARNm puede regular la traducción y conducir a transcripciones de ARN abortadas en enfermedades de expansión por repetición de hexanucleótidos.

G-quadruplex en transcripción y traducción. (A) Las secuencias de pG4 están presentes en aproximadamente el 50% de los promotores de genes humanos. La formación de G-quadruplex podría afectar el inicio de la transcripción por la ARN polimerasa, o si está presente en la hebra antisentido inhibir la transcripción. (B) La presencia de G-cuádruplex formados en la UTR 5 'de los ARNm puede regular la traducción y conducir a transcripciones de ARN abortadas en enfermedades de expansión por repetición de hexanucleótidos.

Los estudios de todo el genoma también revelaron que las pG4 están altamente enriquecidas en los sitios de hipersensibilidad a la DNasaI (97) y se correlacionan con una baja ocupación de nucleosomas (93). En consecuencia, los pG4 podrían afectar la deposición de proteínas reguladoras y / o alterar la estructura y estabilidad de la cromatina. El vínculo entre los G-cuádruplex y la cromatina se destaca por el remodelador de cromatina ATRX (alfa-talasemia / retraso mental ligado al X) que junto con su socio de interacción DAXX funciona como un complejo de histona-chaperona en la deposición de la variante de histona H3.3 , estabilizando así la cromatina (98). ATRX se localiza en heterocromatina pericéntrica y telómeros, y los análisis de todo el genoma en células humanas y de ratón revelaron que se une a secuencias ricas en GC, de las cuales una fracción significativa son pG4. In vitro Se demostró que ATRX se une a G-cuadruplex (99). Las mutaciones que causan enfermedades en ATRX afectan una variedad de procesos nucleares fundamentales, incluida la transcripción. El síndrome de ATRX está asociado con la talasemia, que se atribuye a la regulación a la baja de la α-globina a través de la unión de ATRX a las repeticiones de pG4s aguas arriba del gen. Curiosamente, tanto la proximidad como la longitud del número variable de repeticiones en tándem afectaron la gravedad del silenciamiento génico, lo que sugiere una causa directa por pG4. Alternativamente, en base a las observaciones de los estudios de replicación en células DT40 de aves (100, 101), se concluyó que el silenciamiento transcripcional se produjo a través de G-quadruplex impidió la replicación del ADN (Figura 5) que afecta la transcripción a través de la herencia inapropiada de las marcas de histonas epigenéticas. Curiosamente, la inestabilidad epigenética puede surgir de un G-quadruplex ubicado a una distancia de hasta 3500 pares de bases desde el sitio de inicio de la transcripción (13). Aunque estas observaciones proporcionan evidencia convincente de la participación de pG4 en la regulación de la expresión génica en vivo, queda por probar si el mecanismo de regulación transcripcional es directamente a través de la formación de G-quadruplex. Si la formación de G-quadruplex es el mecanismo, entonces su ocurrencia (y regulación) debería diferir entre varias células diferenciadas.

G-quadruplex y replicación. Los G-cuádruplex formados durante la replicación cuando el ADN es transitoriamente monocatenario impiden la replicación y deben resolverse para permitir que la maquinaria de replicación, incluida la ADN polimerasa, proceda para la síntesis de ADN de la cadena principal y retrasada. Se sabe que los G-quadruplex se resuelven mediante helicasas de desenrollado G-quadruplex como FANCJ, que tiene una direccionalidad 5′-3 ′. Otras helicasas como BLM y WRN tienen una direccionalidad 3′-5 ′. Otras proteínas o enzimas, como las polimeras, también funcionan en el bypass exitoso de los G-quadruplex.

G-quadruplex y replicación. Los G-cuádruplex formados durante la replicación cuando el ADN es transitoriamente monocatenario impiden la replicación y deben resolverse para permitir que la maquinaria de replicación, incluida la ADN polimerasa, proceda para la síntesis de ADN de la cadena principal y retrasada. Se sabe que los G-quadruplex se resuelven mediante helicasas de desenrollado G-quadruplex como FANCJ, que tiene una direccionalidad 5′-3 ′. Otras helicasas como BLM y WRN tienen una direccionalidad 3′-5 ′. Otras proteínas o enzimas, como las polimerasas, también funcionan en el desvío exitoso de los G-quadruplex.

Las predicciones computacionales han revelado que los pG4 de ARN también están presentes en la región no traducida (UTR) 5 'de muchos genes y la participación de los G-cuádruples en la regulación de la traducción ha sido demostrada por in vitro y en vivo estudios (Figura 2D) (24). Hace más de una década, estudios pioneros sobre el retraso mental X frágil, que surge de la expansión repetida de (CGG) n, sugirieron por primera vez que los G-cuádruples en el ARNm estaban involucrados en la función neuronal (102) y eran el objetivo de la proteína de retraso mental FMRP. FMRP se une específicamente a su propio ARNm a través de un G-quadruplex presente en su UTR 5 ', lo que impide la traducción dando lugar a perfiles de traducción de ARNm cerebral alterados (103). Una investigación reciente sobre el papel de la ARN helicasa eIF4A, utilizando la huella del ribosoma para proporcionar instantáneas de traducción a través del transcriptoma, ha revelado que el sello distintivo de las transcripciones dependientes de eIF4A es una firma pG4 de 12 nucleótidos (CGG).4 que pueden formar estructuras de ARN G-quadruplex (104). eIF4A promueve la leucemia linfoblástica aguda de células T al ayudar a la traducción de ARNm con UTR largas y complejas. Por lo tanto, estos resultados implican a los ARN G-quadruplex en la regulación de la traducción de varios oncogenes (Figura 4B) (104). Además, se ha demostrado que pG4 en el 3 'UTR de algunos ARNm está involucrado en la poliadenilación alternativa y el acortamiento de las transcripciones (25).

La evidencia directa de proteínas que se unen y resuelven ARN G-cuádruplex es escasa, con la excepción de estudios recientes sobre la ARN helicasa RHAU. Se demostró que esta resolvasa dependiente de ATP se une con una alta afinidad y especificidad a muchos ARN que contienen pG4, incluida la telomerasa ARN TER, y resuelve G-cuadruplex in vitro (60, 62). Las mutaciones en pG4 en TER dan lugar a un fenotipo telomérico (105). Además, como se mencionó anteriormente, los G-cuádruplex que se forman en el ARNm que surge de la expansión de repetición de hexanucleótidos (GGGGCC) n conducen a transcripciones de ARN abortadas y a una perturbación del procesamiento del ARN (44).

La larga repetición de telómeros rica en G que contiene ARN (TERRA) que resulta de la transcripción del ADN telomérico humano y de levadura (106, 107) adopta, como era de esperar, estructuras G-cuádruplex. in vitro ( 26, 108). In vitro Los estudios han demostrado que la proteína de unión a telómeros de mamíferos TRF2 puede interactuar con TERRA G-quadruplex, lo que puede sugerir un papel en la organización de los telómeros (39). Dado el gran repertorio estructural de ARN, es probable que surjan roles adicionales de ARN G-cuádruplex (y otras estructuras de orden superior) en los procesos regulatorios.

G-quadruplex en replicación e inestabilidad del genoma

Los ADN G-cuádruplex parecen tener un papel doble en la regulación de la replicación del ADN: como impedimentos para la replicación que en los antecedentes mutantes conducen a la inestabilidad del genoma, y ​​como componentes de los orígenes de replicación de los metazoos (Figuras 5 y 6).

G-quadruplex y el inicio de la replicación del ADN. Los orígenes de la replicación en ratones y humanos son ricos en GC y contienen pG4. La formación de G-quadruplex es necesaria para el inicio de la replicación del ADN y la localización del G-quadruplex determina el sitio de inicio (modificado después de (117)).

G-quadruplex y el inicio de la replicación del ADN. Los orígenes de la replicación en ratones y humanos son ricos en GC y contienen pG4. La formación de G-quadruplex es necesaria para el inicio de la replicación del ADN y la localización del G-quadruplex determina el sitio de inicio (modificado después de (117)).

Existe una creciente evidencia de que tanto las ADN polimerasas especializadas como las helicasas funcionan en la replicación de G-quadruplex para prevenir la inestabilidad genética y epigenética (Figura 5) (45, 109). Los conocimientos sobre el papel de las helicasas G-quadruplex en la replicación del ADN han surgido de estudios sobre síndromes de inestabilidad del genoma que son causados ​​por mutaciones de pérdida de función en una u otra de tales helicasas (Figura 5A). En C. elegans que contienen una mutación de pérdida de función en el gen DOG-1, las deleciones se acumulan en las regiones genómicas que contienen pG4s (46). Los estudios sobre otras helicasas, como por ejemplo FANCJ, WRN, BLM y Pif1, apoyan y amplían estos hallazgos. Si bien la helicasa WRN parece ser necesaria principalmente para la replicación del ADN telomérico, de acuerdo con los pacientes con síndrome de Werner (que tienen mutaciones en la helicasa WRN) que muestran senescencia prematura y acortamiento acelerado de los telómeros. FANCJ, así como la helicasa Pif1 o BLM también actúan en las regiones genómicas internas y son necesarias para la integridad del genoma (45, 109). Las mutaciones en la helicasa FANCJ conducen a grandes deleciones que se asignan a pG4 en el genoma (48). La demostración de que FANCJ desenrolla preferentemente G-quadruplex in vitro sugirió que la helicasa FANCJ como DOG1, funciona resolviendo G-cuadruplex formados durante la replicación (Figura 5B). En vivo La evidencia del estancamiento de la horquilla de replicación causado por pG4 provino de un elegante estudio en una línea celular aviar DT40 deficiente en la polimerasa de translesión REV1 (100). En este estudio, los sitios de las bifurcaciones estancadas se mapearon en pG4 y, además, los autores demostraron que el estancamiento se debía a la presencia de una secuencia de formación G-quadruplex, en lugar de una secuencia rica en G. De manera significativa, se encontró que la falta de mantenimiento de la replicación procesiva del ADN conduce al desacoplamiento de la síntesis de ADN y el reciclaje de histonas, y además que la inestabilidad epigenética asociada a pG4 se debe a mutaciones en tres helicasas implicadas en el desenrollamiento de estructuras G-quadruplex (FANCJ, WRN y BLM) (100, 101). Las observaciones recientes también proporcionan evidencia directa de que ATRX juega un papel en la ayuda a la replicación. La disfunción de ATRX indujo defectos de replicación y aumentó el número de mecanismos de respuesta al daño del ADN en los telómeros de las células madre embrionarias de ratón (110). Esta observación, junto con el conocimiento de que ATRX apunta a pG4s (97), sugiere que en este caso también los G-quadruplex también podrían ser la causa del estancamiento de la horquilla de replicación. Recientemente se han identificado mutaciones en ATRX humano en tumores que mantienen sus telómeros mediante una vía independiente de la telomerasa (el alargamiento alternativo de los telómeros (ALT)) que implica la recombinación homóloga, lo que implica defectos de replicación en los telómeros de las células ALT (111). La evidencia de la inestabilidad del genoma que surge de la replicación defectuosa también proviene de estudios en los que el minisatélite subtelomérico humano CBE1, que forma la estructura G-cuádruplex in vitro (80), se insertó en el genoma de la levadura deficiente en Pif1 (52, 54). Además, se demostró que la replicación se ralentizó en las proximidades de pG4 y que la rotura del ADN se produjo en estos sitios en Pif1 deficiente. S. cerevisiae. De manera convincente para el papel de Pif1 en la resolución de G-quadruplex, la rotura del ADN asociada a G-quadruplex podría ser suprimida por la expresión ectópica de Pif1 (51, 112). De manera similar, en el estudio que utilizó anticuerpos dirigidos contra G-cuadruplex (78) se demostró que el número de focos de daño del ADN aumentó significativamente durante la fase S, lo que sugiere que los focos representan G-cuadruplex formados durante la replicación. Si bien esto podría ser cierto, la co-localización de estos focos con ADN recién sintetizado reforzaría la conclusión (78).

El gran tamaño de los genomas de los metazoos, donde la replicación se produce a partir de unos 30 000 a 50 000 orígenes de replicación en células humanas o de ratón (y posiblemente contienen al menos 10 veces más orígenes potenciales), impidió su identificación durante muchos años. Sin embargo, los análisis mejorados de todo el genoma de los sitios activos de inicio de la replicación del ADN ahora han podido abordar la especificidad de la secuencia de los orígenes de la replicación. Contrariamente a las secuencias de consenso ricas en AT para los orígenes en S. cerevisiae, 80-90% de todos los orígenes en células humanas y de ratón contienen regiones ricas en GC que forman elementos repetidos ricos en G (Figura 6) (19, 21, 113). Esta característica rica en GC se conserva en los orígenes de replicación de las plantas (114). Estos elementos de secuencia tienen los rasgos característicos de las secuencias formadoras de G-cuádruplex, y tales estructuras pueden ser más importantes que la especificidad de la secuencia para marcar el inicio de la replicación del ADN a partir de cualquiera de las cadenas de ADN (Figura 6) (115). Recientemente se argumentó que la alta incidencia de pG4 en los orígenes podría ser una sobreestimación debido a la digestión ineficaz de la estructura G-quadruplex por la exonucleasa utilizada en el mapeo (116). Sin embargo, datos experimentales convincentes muestran que de hecho se requiere un G-quadruplex para el inicio de la replicación. en vivo (117). Sin embargo, queda por entender cómo se seleccionan los orígenes de replicación potenciales dentro de un replicón para la activación en diferentes tipos de células y puede involucrar la diafonía entre el genoma, la organización de la cromatina y la replicación y transcripción (115, 118). Estos datos no solo son importantes para nuestra comprensión del control de la replicación del ADN en eucariotas superiores, sino que pueden tener un impacto en la ciencia aplicada al permitir que la construcción de vectores de replicación autónoma se utilicen en la terapia de genes y células madre.


¡Descargar ahora!

Le facilitamos la búsqueda de libros electrónicos en PDF sin tener que buscar. Y al tener acceso a nuestros libros electrónicos en línea o al almacenarlos en su computadora, tiene respuestas convenientes con el Capítulo 18 Regulación de respuestas de expresión genética. Para comenzar a encontrar las respuestas del Capítulo 18 Regulación de la expresión genética, tiene razón en encontrar nuestro sitio web que tiene una colección completa de manuales enumerados.
Nuestra biblioteca es la más grande de estas que tiene literalmente cientos de miles de productos diferentes representados.

Finalmente recibí este libro electrónico, ¡gracias por todas estas respuestas del Capítulo 18 Regulación de la expresión genética que puedo obtener ahora!

No pensé que esto funcionaría, mi mejor amigo me mostró este sitio web, ¡y funciona! Obtengo mi eBook más buscado

¡¿Qué es este gran libro electrónico gratis ?!

¡Mis amigos están tan enojados que no saben cómo tengo todos los libros electrónicos de alta calidad que ellos no saben!

Es muy fácil obtener libros electrónicos de calidad)

tantos sitios falsos. este es el primero que funcionó! Muchas gracias

wtffff no entiendo esto!

Simplemente seleccione su botón de clic y luego descargar, y complete una oferta para comenzar a descargar el libro electrónico. Si hay una encuesta, solo toma 5 minutos, pruebe cualquier encuesta que funcione para usted.


Ver el vídeo: Regulación de la transcripción. Khan Academy en Español (Junio 2022).


Comentarios:

  1. Jugrel

    El hermoso mensaje

  2. Madelon

    La gente en tales casos dice: Ahal sería tío, mirándose a sí mismo.

  3. Dominique

    La pregunta es la respuesta ideal.

  4. Ewald

    Pocos pueden presumir de tanta ingeniosidad como el autor.

  5. Caine

    Los primeros no saben quién es Bill Gates, y los segundos no lo quieren. En el culo, un jinete herido no correrá lejos. El amor por el dinero es más barato. El sexo es hereditario. Si tus padres no han tenido relaciones sexuales, entonces tus posibilidades de tener relaciones sexuales son escasas.

  6. Josu?

    Hablemos, para mí, es qué contar sobre esta pregunta.

  7. Marleigh

    Realmente no entiendo lo que significa.



Escribe un mensaje