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¿Cuál es el papel del acetato de potasio en la extracción de plásmidos?

¿Cuál es el papel del acetato de potasio en la extracción de plásmidos?


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¿Cuál es el papel del acetato de potasio en el método de lisis alcalina de extracción de plásmidos?

Antes pensaba que su función era proteger el ADN plasmídico (lo mismo que el acetato de sodio en la extracción de ADN genómico). Cuando se agrega etanol al 100%, el ADN precipita y luego eliminamos los iones de potasio del sedimento usando etanol al 70%.

Sin embargo, he leído que el acetato de potasio no tiene la misma función que el acetato de sodio en el aislamiento del ADN genómico, sino que es un agente neutralizante que ayuda a renaturalizar el ADN plasmídico pequeño.

Estoy un poco confundido acerca del papel del acetato de potasio y por qué no se puede usar acetato de sodio en su lugar.


El método de lisis alcalina de purificación de plásmidos implica la adición de dodecilsulfato de sodio para lisar las células e hidróxido de sodio (una base fuerte) para la dentadura del ADN. Luego se agrega acetato de potasio por dos razones:

  1. El tampón de acetato ácido neutraliza la solución y permite la renaturalización de los plásmidos catenados.
  2. El dodecilsulfato de potasio es poco soluble en agua. La adición de potasio a las soluciones de dodecilsulfato lo precipita, lo que facilita su eliminación.

Primero, el plásmido es la molécula de ADN circular separada del cromosoma, que es capaz de reproducirse a sí mismo. La extracción del plásmido se realiza mediante el método de lisis alcalina. Principio básico: la suspensión de bacterias se expone en los alquilbencenosulfonatos lineales fuertes de pH alto. Luego, se piroliza la pared celular. El ADN cromosómico se desnaturaliza con proteínas. Se entrelazan para formar un gran complejo que luego se recubre con dodecil dulfato. Cuando el ión potasio es reemplazado por ión sodio, el complejo se deposita en la solución. Después de la centrifugación para el complejo, existe ADN plasmídico en el sobrenadante. El ADN está cargado negativamente, mientras que la columna de extracción de plásmidos es el equivalente a la columna de aniones y puede adsorber el ADN en condiciones de alto contenido de sal. Después de eluir la columna con agua desionizada, se obtiene el ADN plasmídico purificado.

Principalmente tiene como objetivo suspender las bacterias. Tris-HCl es la solución tampón que mantiene constante el pH del sistema de reacción EDTA-Na2 es el agente quelante de metales, que actúa sobre la unión de iones metálicos en microorganismos e inhibiendo la actividad de la ADNasa La glucosa puede mejorar la viscosidad de la solución, mantener la suspensión bacteriana y retrasar el tiempo de sedimentación. Se debe validar si se ha agregado ARNasa A durante el uso de la Solución I. La ARNasa A tiene como objetivo eliminar el ARN. Si las bacterias no se mezclan completamente, la lisis se verá afectada. Por tanto, la concentración del plásmido extraído es muy baja. Debido a que la enzima ARN pertenece a la proteína, la Solución I que contiene ARNasa A debe almacenarse a baja temperatura (4 ° C) debido a la escasa estabilidad de la proteína.


Aislamiento de ADN plasmídico - neutralización de ADN (09 / Jul / 2009)

Tengo una duda si alguien puede sugerirme. Durante la preparación del plásmido. por el método de lisis alcalina, si es posible hacerlo con acetato de sodio 3 M en lugar de acetato de potasio 3 M, ya que ambos tienen el mismo papel en la precipitación del ADN. ¿Cómo pueden ambos cationes influir en la precipitación del ADN en rendimiento y calidad?

Cualquier sugerencia será bienvenida

Respuesta corta, no. El dodecilsulfato de potasio se precipita, mientras que el dodecilsulfato de sodio (SDS) es soluble. La precipitación de la SDS es una parte clave para sacar el ADN genómico de la solución, lo que permite que el ADN plasmídico permanezca libre y luego se transfiera a la columna después de centrifugar los restos celulares, KDS, ADN genómico.

phage434 el 9 de julio de 2009, 02 & # 5844 PM dijo:

Gracias por la respuesta. Pero la última vez, cuando usé acetato de sodio 3M para miniprep, todavía obtuve el ADN plasmídico que estaba bien e incluso el resultado de la secuenciación está bien. Aunque nunca intenté hacer procedimientos posteriores como digestión de restricción y transcripción.

Siento que será útil hablar más sobre esto.

¿Por qué preguntaste "es posible" si ya lo hiciste?

HomeBrew el 9 de julio de 2009, 03 & # 5837 PM dijo:

Cuando hice la publicación, esa vez no tenía mis resultados de secuenciación conmigo, antes de usar la solución para la próxima vez tenía dudas sobre el uso de 2 cationes y siento que es mejor discutir las dudas en este foro. y luego me sentí compartiendo la experiencia también.

De acuerdo, me di cuenta de que sus dos primeras publicaciones estaban separadas por unas pocas horas, y pensé que lo haría.


Lisis alcalina

La lisis alcalina es el método de elección para aislar ADN plasmídico circular, o incluso ARN, de células bacterianas. Probablemente sea una de las técnicas más útiles en general porque es una forma rápida, confiable y relativamente limpia de obtener ADN de las células. Si es necesario, el ADN de una preparación de lisis alcalina se puede purificar más.

La lisis alcalina depende de una propiedad única del ADN plasmídico. Es capaz de recocer rápidamente después de la desnaturalización. Esto es lo que permite que el ADN plasmídico se separe del cromosoma bacteriano.

Por lo general, cultivará células de E. coli que contienen el plásmido que desea aislar, luego lisará las células con álcali y extraerá el ADN del plásmido. Los restos celulares se precipitan usando SDS y acetato de potasio. Esto se centrifuga y se retira el gránulo. Luego, se usa isopropanol para precipitar el ADN del sobrenadante, se elimina el sobrenadante y el ADN se resuspende en tampón (a menudo TE). Una mini preparación generalmente rinde de 5 a 10 ug. Esto se puede escalar a una preparación midi o una preparación maxi, lo que producirá cantidades mucho mayores de ADN (o ARN).

Los protocolos específicos para la lisis alcalina difieren ampliamente de un laboratorio a otro, e incluso de un científico a otro. Sin embargo, los principios básicos detrás del procedimiento son bastante uniformes. Aquí están:

1. Gire sus células. Su ADN todavía está en las células, por lo que está en el sedimento en esta etapa.

2. Deseche el sobrenadante. Las bacterias liberan trozos de pared celular que flotan en el sobrenadante. Estas piezas de la pared celular pueden inhibir la acción de las enzimas en su ADN final, por lo que es importante deshacerse de todo el sobrenadante e incluso invertir el tubo y limpiar el labio con una toallita Kim o Q-tip.

3. Resuspender las células en tampón (a menudo Tris) y EDTA. El EDTA quela los metales divalentes (principalmente magnesio y calcio). La eliminación de estos cationes desestabiliza la membrana celular. También inhibe las DNasas. También se debe agregar glucosa para mantener la osmolaridad y evitar que el tampón reviente las células.

4. Lyse las células con hidróxido de sodio (NaOH) y SDS. Esta solución altamente alcalina dio lugar al nombre de esta técnica. Mezcle esto mediante una inversión suave e incube en hielo durante cinco minutos (pero no más, o su ADN se desnaturalizará irreversiblemente). Suceden tres cosas durante esta etapa:

a.SDS hace estallar agujeros en las membranas celulares. El SDS (dodecil-lauril sulfato de sodio) es un detergente que se encuentra en muchos artículos comunes, como jabón, champú y pasta de dientes.

b) El NaOH afloja las paredes celulares y libera el ADN plasmídico y el ADN celular cortado.

c) El NaOH desnaturaliza el ADN. El ADN celular se linealiza y las hebras se separan. El ADN plasmídico es circular y permanece constreñido topológicamente.

5. Renaturalice el ADN plasmídico y elimine la basura. Agregue acetato de potasio (KAc), que hace tres cosas:

a) Se permite la renaturalización del ADN circular. El ADN celular cortado permanece desnaturalizado como ADN monocatenario (ssDNA).

b) El ssDNA se precipita, ya que las grandes moléculas de ssDNA son insolubles en sal.

c. Agregar acetato de potasio a la SDS forma KDS, que es insoluble. Esto permitirá eliminar fácilmente la SDS de su ADN plasmídico.

Ahora que ha facilitado la separación de muchos de los contaminantes, centrifugue para eliminar los restos celulares, KDS y ssDNA celular. Su ADN plasmídico está en el sobrenadante, mientras que toda la basura está en el sedimento.

6. Precipitar el ADN plasmídico mediante precipitación con alcohol. (etanolor isopropanol) y una sal (como acetato de amonio, cloruro de litio, cloruro de sodio o acetato de sodio) y centrifugarlo. El ADN tiene carga negativa, por lo que agregar una sal enmascara las cargas y permite que el ADN se precipite. Esto colocará su ADN en el sedimento.

7. Enjuague el pellet.—Su ADN plasmídico— en EtOH al 70% helado y secar al aire durante unos 10 minutos para permitir que el EtOH se evapore.

8. Resuspenda su ADN ahora limpio sedimento en tampón (a menudo Tris) y EDTA más RNasas para escindir cualquier ARN restante. Su ADN ahora está nuevamente en solución.

El ADN de esta pureza es bueno para varios usos, como en vitrotranscripción o traducción o corte con algunas enzimas. Si está secuenciando o transformando este ADN en células de mamíferos, querrá utilizar técnicas de purificación adicionales como la extracción con fenol, la purificación en columna Qiagen o la purificación a base de sílice.


Papel del acetato de sodio en la extracción / precipitación de ADN - (22 / Mayo / 2013)

Me confundí un poco sobre el papel del acetato de sodio en los protocolos de extracción de ADN.
Me dijeron que ayuda a neutralizar la carga de ADN para que el ADN pueda precipitarse más fácilmente con el etanol agregado.
Sin embargo, también vi en algunas páginas web que también ayuda a precipitar el ADN al unirse a proteínas (unidas al ADN).

Puedo entender que ayuda a precipitar el ADN, pero si precipita con las proteínas ADN +, ¿cómo se deshacen de esas proteínas después de la precipitación?
Porque simplemente lo "limpia" con etanol para eliminar las sales, pero no elimina las proteínas, ¿o sí?

La función es aumentar el número de iones en solución hasta un punto en el que el ADN pueda precipitarse mediante la adición de un alcohol principalmente. En algunas extracciones como las preparaciones de plásmidos, se utiliza para neutralizar el componente alcalino de la lisis (paso 2 NaOH y SDS) y precipitar las proteínas y el ADN genómico de este paso, nuevamente mediante fuerza iónica.

bob1 el miércoles 22 de mayo 21:02:18 2013 dijo:

Sí, entiendo esto.
Pero en el caso del ADN genómico: si precipitas el ADN con las proteínas, ¿esto causa problemas? ¿O no es un problema tener muchas proteínas también para (por ejemplo) una prueba de secuenciación de ADN?

La mayoría de las extracciones de ADN tienen un paso caotrópico que desnaturaliza las proteínas que luego se eliminan antes del paso de precipitación del ADN.

bob1 el jueves 23 de mayo 08:50:12 2013 dijo:

Si quieres un ADN razonablemente limpio, sí. Incluso las extracciones de ADN relativamente impuras, como las que se utilizan para el cribado de la punta de la cola de los ratones, tendrán un proceso en el que las proteínas se digieren y se salan antes de que se precipite el ADN.

bob1 el jueves 23 de mayo 20:41:17 2013 dijo:

Sí, aunque en el caso de las proteínas son los iones Na + en lugar del acetato.


E. coli Protocolo MiniPrep de ADN plasmídico

El aislamiento de ADN plasmídico de E. coli el uso de una lisis alcalina es un método bien establecido. E. coli con plásmido se cultiva en medio con antibióticos hasta una densidad celular alta, se recolecta y luego se lisa con una solución de SDS / NaOH. La rápida acidificación con acetato de potasio concentrado provoca la precipitación de proteínas y ADN cromosómico. El ADN plasmídico, que está superenrollado, permanece en solución y se puede capturar en una columna giratoria de sílice. El ADN plasmídico se lava con una solución de etanol y luego se eluye en agua o tampón TE.

  • Tubos de microfuga
  • Tampón de resuspensión (Tris HCl 50 mM, pH 8, EDTA 10 mM, 100 y microg / ml RNasa A)
  • Tampón de lisis (NaOH 0,2 N, SDS al 1%)
  • Tampón de neutralización (acetato de potasio 3/5 M, pH 6)
  • Girar columnas (número de producto SSC 100-01)
  • Isopropanol
  • Tampón de lavado (etanol al 70%)
  • Tampón de elución (agua o tampón TE - Tris 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM)

Cultura E. coli con plásmido en medio LB con presión selectiva de antibiótico, durante la noche en un agitador a 37 ° C.

Pellet 1,5 ml de cultivo bacteriano en un tubo de microcentrífuga centrifugando durante 2 minutos a 10.000 rpm.

Decante el sobrenadante y agregue 200 microlitros del tampón de resuspensión. Para resuspender el gránulo, es posible que deba agitarlo con el vórtex.

Agregue 250 microlitros del tampón de lisis, invierta el tubo 10 veces para mezclar bien. La solución debe volverse clara y viscosa.

Agregue 350 μl del tampón de neutralización, invierta el tubo 10 veces o hasta que se forme un precipitado. El precipitado es una mezcla de proteína y ADN cromosómico.

Centrifugue el tubo durante 10 minutos a 10.000 rpm. Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga y agregar 0,7 isopropanol. Incubar a -20 ° C durante 15 minutos.

Transfiera la solución a una columna de centrifugado.

Centrifugue la columna de centrifugado durante 1 minuto a 7.000 rpm. Deseche el flujo a través.

Añada 400 μl del tampón de lavado y centrifugue durante 1 minuto a 7.000 rpm. Deseche el flujo a través. Repita este paso.

Centrifugue durante 2 minutos más a 10.000 rpm para eliminar el tampón de lavado residual.

Transfiera la columna a un tubo de microcentrífuga limpio. Añada 50 µl de tampón de elución y centrifugue durante 1 minuto a 10.000 rpm.

Tabla 1: El plásmido eluido se leyó en un espectrofotómetro DeNovix para determinar la concentración. La máquina se puso en blanco con agua desionizada.

Nombre de muestra Concentración (ng / y microl) 260/280 260/230
E. coli DH5α con pSVβ 1143.41 2.06 2.38

Figura 1: El plásmido aislado se sometió a una digestión enzimática con HindIII (procedente de NEB) y se ejecutó en un gel de agarosa con bromuro de etidio, junto a dos carriles de escaleras Lambda digeridas (haga clic para ampliar la imagen).


Un plásmido es un ADN cromosómico adicional que está presente de forma natural en algunas bacterias pero también está presente en algunos eucariotas, p. Dictyostelium purpureum. Puede replicarse independientemente del cromosoma del huésped. El plásmido es circular y bicatenario y lleva pocos genes y su tamaño varía de 1 a más de 200 kilo pares de bases.

Estructura del plásmido

Contiene tres componentes:

  1. un origen de replicación,
  2. un policonector para clonar el gen de interés (llamado sitio de clonación múltiple donde se escinden las enzimas de restricción), y
  3. un gen de resistencia a los antibióticos (marcador seleccionable).

Tipos de plásmidos

Clasificación sobre la base de su capacidad de transferir a bacterias adicionales

Tipo conjugativo: Conserva los tragenes, que llevan a cabo el intrincado proceso de conjugación, la transferencia de un plásmido a otra bacteria.

Clases de transición: Se considera movilizable, contiene solo un subconjunto de los genes necesarios para una transferencia exitosa. Tiene la capacidad de parasitar un plásmido conjugativo transfiriendo a alta frecuencia exclusivamente en presencia de este. Actualmente, se usa para manipular el ADN y podría usarse potencialmente como dispositivos para curar enfermedades. Es posible que varios plásmidos coexistan en una sola célula.

Clasificación funcional de plásmidos.

  1. Fertilidad
  2. Plásmido R
  3. Plásmido Ti inductor de tumores en plantas
  4. Degradante
  5. Col-plásmido

Plásmido de fertilidad

F-Plasmid transporta los genes de fertilidad (tra-genes) para la conjugación, la transferencia de información genética entre dos células. También se conoce como episoma porque se integra en el cromosoma del huésped y promueve la transferencia de células bacterianas de ADN cromosómico.

Plásmido resistente a antibióticos

R-Plasmid contiene genes que codifican resistencia a antibióticos o venenos. Ejemplos de plásmido R-pBR322. Contiene genes de resistencia a tetraciclina y ampicilina.

Inducción de tumor de plásmido Ti en planta:

Contiene A. tumefaciens, que llevan instrucciones para que las bacterias se conviertan en patógenos al cambiar al estado tumoral, sintetizan opiniones, toxinas y otros factores de virulencia. Esto transfiere efectivamente genes extraños a ciertas células vegetales.

Plásmidos degradantes

Col-plásmidos

Contienen genes que codifican los polipéptidos antibacterianos llamados
bacteriocinas, una proteína que mata otras cepas de bacterias. Las proteínas col de E. coli están codificados por proteínas como Col E1.

Aislamiento de plásmidos

  1. Se introdujeron 1,5 ml de cultivo de crecimiento durante la noche en un tubo Eppendorf.
  2. A continuación, las células se centrifugaron a 12000 rpm durante 2 minutos a 4ºC.
  3. Después de la recolección, el sobrenadante se descartó y los sedimentos se resuspendieron en 100 ml de la solución 1.
  4. Luego, se agregaron 200 ml de la solución 2 y los tubos se mezclaron por inversión
  5. Se añadieron 150 ml de la solución 3 a la mezcla y se mezclaron girando los tubos.
  6. A continuación, los tubos se incubaron en hielo durante 5 minutos.
  7. Después de esto, los tubos se centrifugaron a 12000 rpm durante 5 minutos.
  8. Luego, se tomó el sobrenadante y se transfirió al nuevo tubo.
  9. Se añadió a los tubos 0,6 veces el volumen de isopropanol o dos veces el volumen de etanol y se agitaron en vórtex.
  10. Después de la agitación con vórtex, los tubos se centrifugaron a 12000 rpm durante 10 minutos.
  11. Se descartó el sobrenadante y se lavó el sedimento con etanol al 70%.
  12. Los tubos se centrifugaron a 12000 rpm durante 5 minutos y se descartó el sobrenadante.
  13. Luego, los tubos se dejaron secar después de lo cual el sedimento se disolvió en tampón TE.

Teclas: La solución 1 (tampón de resuspensión) contiene tampón de clorhidrato de tris

Glucosa-agente osmótico-pérdida de contacto de célula a célula

Solución 2 (tampón de lisis) recién preparada, contiene hidróxido de sodio al 0,2% y SDS al 1%


Conclusión

En general, el método de amplificación de desplazamiento múltiple proporcionó la mayor variedad de plásmidos de resistencia de las muestras cecales investigadas. Sin embargo, debido a las inconsistencias de los resultados y las dificultades experimentadas con este método, no es el protocolo ideal para usar cuando se trabaja con un gran volumen de muestras en plazos cortos. Los kits comerciales, el método de lisis alcalina y TRACA no proporcionaron una amplia gama de plásmidos de resistencia de nuestra muestra en comparación con los demás probados. Por lo tanto, el método de aislamiento de plásmidos exógenos dio como resultado la gama más amplia de plásmidos de resistencia con facilidad de aplicación y consistencia en todas las muestras. Si bien este método se basa en la capacidad conjugativa de los plásmidos presentes, es un método eficiente (los plásmidos se pueden obtener en un corto período de tiempo) y efectivo (se puede adquirir una buena variedad de plásmidos) que funcionó con todos los plásmidos cecales. muestras analizadas. Por lo tanto, recomendamos el método de aislamiento de plásmidos exógenos cuando se extraen plásmidos de resistencia a antibióticos de relevancia clínica de un gran número de muestras complejas.


¿Cuál es el papel del acetato de potasio en la extracción de plásmidos? - biología

Resumen del artículo:


AISLAMIENTO DE ADN PLÁSMIDO DE E. Coli

El plásmido:
Un plásmido es una pequeña pieza circular de ADN (alrededor de 2.000 a 10.000 pares de bases) que contiene información genética importante para el crecimiento de bacterias. En la naturaleza, esta información suele ser un gen que codifica una proteína que hará que las bacterias sean resistentes a un antibiótico.

Los plásmidos se descubrieron a finales de los sesenta y rápidamente se comprendió que podían utilizarse para amplificar un gen de interés. Como vector se usa un plásmido que contiene resistencia a un antibiótico (generalmente ampicilina). El gen de interés se inserta en el plásmido vector y luego este plásmido recién construido se coloca en E. coli que son sensibles a la ampicilina. Luego, las bacterias se esparcen sobre una placa que contiene ampicilina. La ampicilina proporciona una presión selectiva porque solo las bacterias que han adquirido el plásmido pueden crecer en la placa. Por lo tanto, siempre que cultive la bacteria en ampicilina, necesitará el plásmido para sobrevivir y lo replicará continuamente, junto con su gen de interés que se ha insertado en el plásmido.

Hay muchos tipos diferentes de plásmidos disponibles comercialmente. Todos ellos contienen
1) Un marcador seleccionable (es decir, un gen que codifica la resistencia a los antibióticos),
2) Un origen de replicación (que es utilizado por la maquinaria de fabricación de ADN en las bacterias como punto de partida para hacer una copia del plásmido) y
3) Un sitio de clonación múltiple. El sitio de clonación múltiple tiene muchos sitios de enzimas de restricción (que se discutirán en un laboratorio posterior) y se usa para insertar el ADN de interés.

Conformaciones
El ADN plasmídico puede aparecer en una de las cinco conformaciones, que (para un tamaño determinado) se ejecutan a diferentes velocidades en un gel durante la electroforesis. Las conformaciones se enumeran a continuación en orden de movilidad electroforética (velocidad para un voltaje aplicado dado) de la más lenta a la más rápida:
El ADN del toro "Nicked Open-Circular" tiene un corte de hebra.
El ADN de & bull "Relaxed Circular" está completamente intacto con ambas hebras sin cortar, pero se ha "relajado" enzimáticamente (se han eliminado las superenrollamientos). Puede modelar esto dejando que un cable de extensión retorcido se desenrolle y relaje y luego enchúfelo en sí mismo.
El ADN "lineal" del toro tiene extremos libres, ya sea porque se han cortado ambas hebras o porque el ADN era lineal in vivo. Puede modelar esto con un cable de extensión eléctrico que no esté enchufado a sí mismo.
El ADN de & toro "superenrollado" (o "circular covalentemente cerrado") está completamente intacto con ambas hebras sin cortar y con una torsión incorporada, lo que da como resultado una forma compacta. Puede modelar esto girando un cable de extensión y luego enchufándolo a sí mismo.
El ADN "superenrollado desnaturalizado" del toro es como el ADN superenrollado, pero tiene regiones no aparejadas que lo hacen un poco menos compacto, lo que puede deberse a una alcalinidad excesiva durante la preparación del plásmido. Puede modelar esto girando un cable de extensión muy desgastado y luego enchufándolo a sí mismo.

La tasa de migración de pequeños fragmentos lineales es directamente proporcional al voltaje aplicado a bajos voltajes. A voltajes más altos, los fragmentos más grandes migran a velocidades continuamente crecientes pero diferentes. Por lo tanto, la resolución de un gel disminuye con el aumento de voltaje. A un voltaje bajo especificado, la tasa de migración de pequeños fragmentos de ADN lineal es función de su longitud. Los fragmentos lineales grandes (más de 20 kb aproximadamente) migran a una cierta velocidad fija independientemente de la longitud. Esto se debe a que las moléculas se repiten y la mayor parte de la molécula sigue el extremo principal a través de la matriz de gel. Los digestiones de restricción se utilizan con frecuencia para analizar plásmidos purificados. Estas enzimas rompen específicamente el ADN en ciertas secuencias cortas. Los fragmentos lineales resultantes forman "bandas" después de la electroforesis en gel. Es posible purificar ciertos fragmentos cortando las bandas del gel y disolviendo el gel para liberar los fragmentos de ADN. Debido a su estrecha conformación, el ADN superenrollado migra más rápido a través de un gel que el ADN lineal o circular abierto.

Un plásmido es una molécula de ADN extracromosómico separada del ADN cromosómico que es capaz de replicarse independientemente del ADN cromosómico. En muchos casos, es circular y de doble hebra. Los plásmidos generalmente se encuentran de forma natural en bacterias, pero a veces se encuentran en organismos eucariotas (p. Ej., El anillo de 2 micrómetros en Saccharomyces cerevisiae). El tamaño del plásmido varía de 1 a más de 200 kilopares de bases (kbp). El número de plásmidos idénticos dentro de una sola célula puede ser cero, uno o incluso miles en algunas circunstancias. Los plásmidos pueden considerarse parte del mobiloma, ya que a menudo se asocian con la conjugación, un mecanismo de transferencia horizontal de genes.
El término plásmido fue introducido por primera vez por el biólogo molecular estadounidense Joshua Lederberg en 1952.Los plásmidos pueden considerarse formas de vida independientes similares a los virus, ya que ambos son capaces de replicarse de forma autónoma en entornos adecuados (del huésped). Sin embargo, la relación plásmido-huésped tiende a ser más simbiótica que parasitaria (aunque esto también puede ocurrir con los virus, por ejemplo, con los virus Endo), ya que los plásmidos pueden dotar a sus huéspedes con paquetes útiles de ADN para ayudar a la supervivencia mutua en tiempos de estrés severo. Por ejemplo, los plásmidos pueden transmitir resistencia a los antibióticos a las bacterias hospedadoras, que luego pueden sobrevivir junto con sus huéspedes que salvan vidas y que se transmiten a las generaciones futuras de hospedadores.

Los plásmidos que existen sólo como una o unas pocas copias en cada bacteria están, tras la división celular, en peligro de perderse en una de las bacterias segregantes. Tales plásmidos de copia única tienen sistemas que intentan distribuir activamente una copia a ambas células hijas. Algunos plásmidos incluyen un sistema de adicción o "sistema de muerte possegregacional (PSK)", como el sistema hok / sok (muerte del huésped / supresor de muerte) del plásmido R1 en Escherichia coli. Producen un veneno de larga duración y un antídoto de corta duración. Las células hijas que retienen una copia del plásmido sobreviven, mientras que una célula hija que no hereda el plásmido muere o sufre una tasa de crecimiento reducida debido al veneno persistente de la célula madre.

La lisis alcalina fue descrita por primera vez por Birnboim y Doly en 1979 (Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523) y, con algunas modificaciones, ha sido el método preferido para la extracción de ADN plasmídico de bacterias desde entonces.

La Solución 1 contiene Tris, EDTA, glucosa y RNasa A. Los cationes divalentes (Mg2 +, Ca2 +) son esenciales para la actividad de la DNasa y la integridad de la pared celular bacteriana. El EDTA quela los cationes divalentes en la solución evitando que las ADNasas dañen el plásmido y también ayuda a desestabilizar la pared celular. La glucosa mantiene la presión osmótica para que las células no revienten y se incluye RNasa A para degradar el ARN celular cuando las células se lisan.

El tampón de lisis (solución 2) contiene hidróxido de sodio (NaOH) y el detergente Dodecil (lauril) sulfato de sodio (SDS). El SDS está ahí para solubilizar la membrana celular. El NaOH ayuda a romper la pared celular, pero lo que es más importante, interrumpe el enlace de hidrógeno entre las bases del ADN, convirtiendo el ADN bicatenario (dsDNA) en la célula, incluido el ADN genómico y el plásmido, en ADN monocatenario (ssDNA). Este proceso se llama desnaturalización y es parte central del procedimiento (lisis alcalina). El SDS también desnaturaliza la mayoría de las proteínas en las células, lo que ayuda con la separación de las proteínas del plásmido más adelante en el proceso.

La adición de acetato de potasio (solución 3) devuelve el pH a neutral. En estas condiciones, el enlace de hidrógeno entre las bases del ADN monocatenario se puede restablecer, por lo que el ssDNA puede volver a naturalizarse en dsDNA. El pequeño ADN plasmídico circular re-naturiza pero es imposible aparear adecuadamente el enorme ADN genómico. se estira. Es por eso que es importante ser suave durante el paso de lisis porque una mezcla o agitación vigorosa cortará el ADNg produciendo tramos más cortos que pueden volver a recocerse y contaminar su preparación de plásmido.

Mientras que el plásmido bicatenario se puede disolver fácilmente en solución, el ADN genómico monocatenario, el SDS y las proteínas celulares desnaturalizadas se adhieren mediante interacciones hidrófobas para formar un precipitado blanco. El precipitado se puede separar fácilmente de la solución de ADN plasmídico mediante centrifugación.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
APUNTAR
Para aislar el ADN plasmídico de E. coli

PRINCIPIO
Este aislamiento se basa en la liberación de moléculas de ADN de alto peso molecular a partir de las paredes celulares y membranas celulares rotas que disocian el complejo proteico nuclear mediante desnaturalización y proteólisis y separación del ADN de otras macromoléculas observadas.

MATERIALES NECESARIOS
Cultivo nocturno de E. coli
Tubos de ensayo
Centrífugo
Paquete de hielo
Tubos Eppendorf

1. SOLUCIÓN 1 - 5ml
Tris HCl 50 mM
Pipetee 0,25 ml de TrisHCl 1 M en un vaso de precipitados.
EDTA de 20 mM
Pipetee 0,20 ml de EDTA 0,5 M en el vaso de precipitados.
15% de glucosa
Pesar 0,75 gramos de glucosa
Disuelva los productos químicos anteriores y hágalo hasta 5 ml con agua destilada

2. SOLUCIÓN 2 - 5ml
NaOH 0,2 N
Pesar 0.04 gramos de NaOH en un vaso de precipitados
SDS al 1%
Pesar 0,05 gramos de SDS en un vaso de precipitados
Disolver la solución anterior en 3 ml de agua destilada calentando y luego completar hasta 5 ml.

3.SOLUCIÓN 3 - 5ml
Acetato de potasio 5M

PROCEDIMIENTO
& toro Tome 1,5 ml de cultivo nocturno de E. coli en tubos Eppendorf
& bull Los tubos se centrifugan a 6000 rpm durante 10 minutos
& Bull A esto se le añadieron 100 microlitros de la solución 1 y se incubó en condiciones heladas durante 10 minutos.
A continuación, agregue 150 microlitros de la solución 2 y agite suavemente hasta que se forme un líquido viscoso blanco.
& Bull A esto agregue 200 microlitros de solución 3 e incube en condición helada durante 10 minutos
& bull Luego centrifugue los tubos a 10000 rpm durante 10 min.
& toro Luego tome el sobrenadante y agregue un volumen igual de isopropanol a ese
& toro Incubar en condición helada durante 30 min.
Centrifugue estos tubos a 12000 rpm durante 10 minutos.
& bull El pellet se secó bien y se disolvió en 50 microlitros de tampón TE
& Bull Run las muestras en un gel

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Referencias

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Comentarios:

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